Protein reporters to study in vivo protein interactions and aggregation

Resumo

L'objectiu dels dos primers capítols va ser l'aplicació de la tècnica "Bimolecular fluorescent protein complementation" (BIFC) per a detectar interaccions intracel·lulars proteiques de caràcter dèbil in vivo. Durant l'estudi s'ha demostrat que es pot acoblar a la citometria de flux creant una eina d'anàlisi proteòmica. D'altra banda, també es demostra que l'emissió de fluorescència depèn de la força de la interacció. A més a més, el mètode BIFC pot ser aplicat per a obtenir informació sobre la superfície d'interacció. D'altra banda, es descriu l'ús de BIFC com a mètode per a detectar compostos que bloquegen la interacció de proteïnes diana in vivo. Es demostra que la inhibició de una interacció va unida a una disminució en la fluorescència detectada. En el tercer capítol, s'ha investigat el grau de co-agregació in vivo entre dues proteïnes amb tendència a agregar (el pèptid amiloide Aβ42 i la proteïna VP1 que constitueix la càpside viral) co-expressades en E.coli. D'altra banda, l'estructura dels agregats intracel·lulars ha estat investigada per desxifrar si les fibres amiloides i els cossos d'inclusió comparteixen característiques estructurals. Les dades obtingudes indiquen que l'agregació proteica in vivo presenta una remarcable especificitat que depèn de l'establiment d'interaccions selectives i resulta en la formació d'estructures oligomèriques i fibrilars que presenten propietats amiloides En el quart capítol, es descriu un nou mètode per a estudiar l'agregació proteica en llevat. Es basa en la fusió de la proteïna d'interès a un enzim, concretament la di-hidrofolat reductasa (DHFR). L'activitat d'aquest enzim és essencial per al llevat. D'aquesta manera, sota la presència d'un inhibidor d'aquest enzim (anomenat metotrexat), la tendència a agregar de la proteïna diana queda directament lligada a la supervivència i creixement del llevat. En altres paraules, si la proteïna agrega, la DHFR no serà funcional i el llevat serà susceptible a la presència del metotrexat en el medi. Al contrari, si la proteïna no agrega, la DHFR es trobarà soluble en el medi intracel·lular conferint resistència al llevat. Degut al fet que l'agregació està relacionada al creixement, no es necessita cap assaig funcional per a detectar-la. A més a més, l'ús d'un derivat fluorescent del metotrexat permet confirmar l'estat d'agregació o solubilitat de la proteïna diana. D'altra banda, les propietats anti-agregacionals de diferents compostos químics que s'uneixen al pèptid Aβ42 també varen ser avaluades emprant el mètode juntament amb l'efecte de la deleció o la sobre expressió de xaperones en l'agregació de Aβ42.