Comunicación funcional entre canales de Ca2+ tipo l y canales de Ca2+ activados por reservorios y su regulación del tono vascular

Resum

Los vasos sanguíneos se componen de tres capas o túnicas. La túnica media es la encargada en último término de regular la contractilidad arterial y, con ello, la presión sanguínea. Esta capa está compuesta principalmente por células de músculo liso vascular (CMLV), siendo los canales de calcio (Ca2+) tipo L (LTCC) dependientes de voltaje la principal ruta de entrada de Ca2+ en estas células. Sin embargo, existen otros canales de Ca2+ que también pueden participar en la regulación del tono vascular, como los canales de Ca2+ regulados por receptores (ROCC) o los regulados por el vaciado de los reservorios (SOCC). Estudios recientes han determinado un papel relevante de los SOCC en la regulación del tono vascular, aunque su contribución todavía permanece en debate en la comunidad científica. Fisiológicamente, los agonistas vasoactivos se unen a receptores de membrana acoplados a proteína G (GPCR) provocando la síntesis del segundo mensajero inositol trifosfato (IP3), el cual estimula la liberación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico (RS). La disminución de la concentración de Ca2+ en el lumen del RS origina la entrada de Ca2+ a través de los SOCC, conocida como entrada de Ca2+ regulada por los reservorios o SOCE, por sus siglas en inglés, para rellenar posteriormente los almacenes de Ca2+ vacíos. No obstante, el papel de los SOCC dependientes de las proteínas Orai1 y TRPC1 en la contractilidad vascular y su posible interacción con los LTCC, especialmente los canales CaV1.2, todavía se desconoce. Por eso, en el presente trabajo tratamos de caracterizar la coactivación de los SOCC y los LTCC tras la estimulación con agonistas, y determinar la posible comunicación entre Orai1, TRPC1 y CaV1.2. Para estudiar la contractilidad vascular, la movilización del Ca2+ intracelular y la distribución de los canales iónicos se utilizaron anillos aórticos y CMLV aisladas, obtenidos de ratones C57BL/6J wild type y ratones knock-out condicionales de CaV1.2 específico de músculo liso (CaV1.2KO). Determinamos que la serotonina (5-HT) o el vaciado de los reservorios con tapsigargina (TG) aumentaba la concentración de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) y estimulaba una contracción de la aorta, que eran sensibles a inhibidores de LTCC y SOCC. Además, las respuestas inducidas por 5-HT y TG eran significativamente menores en ratones CaV1.2KO. Por otro lado, observamos que la hiperpolarización inactivante de los LTCC inducida por cromakalim o valinomicina redujo significativamente tanto las respuestas a 5-HT como a TG, mientras que esas respuestas se incrementaban con el agonista de los canales CaV1.2, BayK-8644. Además, la técnica in situ Proximity Ligation Assay (PLA) reveló que CaV1.2 interaccionaba con Orai1 y TRPC1 en CMLV en condiciones basales, interacción que aumentaba significativamente después de estimular las células con 5-HT o TG. Los resultados presentados en esta tesis confirman el papel de los SOCC en la regulación del tono vascular y que, tras la estimulación con agonista, la contracción de los vasos implica una entrada de Ca2+ debida a la coactivación de SOCC dependientes de Orai1 y TRPC1 y de LTCC. Además, se demuestra por primera vez una interacción funcional entre los canales CaV1.2 y Orai1, además de TRPC1, pudiendo formar un complejo macromolecular para regular la señalización de Ca2+ y el tono vascular.