Estudio de evolución de proteínas

Zusammenfassung

En la presente Tesis Doctoral titulada “Estudio de evolución de proteínas”, hemos utilizado la resurrección de proteínas ancestrales para abordar diferentes estudios de evolución. Por una parte, hemos estudiado las preferencias energéticas de aminoácidos asociadas a sitios específicos mediante un extenso análisis mutacional de proteínas resucitadas en el laboratorio correspondientes a aproximaciones plausibles de secuencias de tiorredoxinas y β-lactamasas del período Precámbrico. Nuestros resultados apoyan que las preferencias energéticas de aminoácidos asociadas a sitios específicos se conservan durante la evolución a pesar de la divergencia que genera la diversidad química en el espacio de secuencias. Hemos analizado las preferencias energéticas desde un punto de vista molecular y hemos mostrado que diferentes mecanismos simples pueden explicar de forma razonable su conservación durante miles de millones de años. Además, hemos aportado evidencias experimentales de que, en algunos casos, la conservación de las preferencias ancestrales puede implicar la reorganización estructural local ancestral de la región en que ha ocurrido la mutación. Finalmente, hemos mostrado que el supresor global M182T en el gen de la β-lactamasa TEM-1 (relacionado con muchos casos clínicos de resistencia frente a nuevos antibióticos) puede considerarse como una vuelta al estado ancestral energéticamente preferido. Por otra parte, hemos abordado la búsqueda de enzimas de novo con actividades no naturales cruciales en E. coli. Para ello, hemos utilizado el gen que codifica para una β-lactamasa ancestral (GNCA) altamente evolucionable y el gen que codifica para la β-lactamasa de E. coli (TEM-1) para generar genotecas mediante técnicas de Biología Molecular, obteniendo genotecas del orden de 10^12 moléculas. Mediante cepas de la colección Keio, hemos llevado a cabo experimentos de complementación al objeto de seleccionar variantes proteicas que puedan conferir funciones metabólicas cruciales en E. coli. Hemos estudiado un total de 25 cepas auxotróficas y, después de verificar los resultados mediante diferentes pruebas para eliminar falsos positivos y secuenciar las variantes, hemos obtenido un total de 11 variantes que rescatan hasta 3 cepas auxotróficas. En concreto, hemos obtenido una variante actual que suprime la auxotrofia de ΔhisI; dos variantes actuales y dos variantes ancestrales que suprimen la auxotrofia de ΔlipA y finalmente, 5 variantes actuales y una ancestral que suprimen la auxotrofia de ΔproB. A priori, los resultados obtenidos a partir de los ensayos de actividad para una de las variantes (ProB-G1) que rescata la cepa ΔproB no muestran actividad γ-glutamil quinasa significativa. Aunque, obviamente, restan experimentos por realizar para la confirmación de las variantes obtenidas, nuestros resultados son muy prometedores y podrían aportar información para una de las cuestiones más importantes en la ingeniería de proteínas, la generación de enzimas de novo. 1) Risso, VA., Manssour-Triedo, F., Delgado-Delgado, A., Arco R., Barroso-delJesus, A., Ingles-Prieto, A.,Godoy-Ruiz, R., Gavira, JA., Gaucher, EA., Ibarra-Molero, B. and Sanchez-Ruiz, JM. Mutational studies on resurrected ancestral proteins reveal conservation of site-specific amino acid preferences throughout evolutionary history, Mol. Biol. Evol, 32(2):440-55 (2015)