Resonancia magnética nuclear aplicada al estudio sobre el reconocimiento molecular de ligandos con fucosa mediado por el receptor dc-sign

Resumo

La presente tesis doctoral se dirige al estudio de la proteína humana DC-SIGN desde una perspectiva estructural, atendiendo a aquellos aspectos que, a nivel molecular, determinan su interacción con sus ligandos de tipo carbohidrato (conformación, interacciones intermoleculares (vdW)¿). El interés por estudiar dicha proteína se ha acrecentado desde comienzos de este siglo, cuando DC-SIGN fue definitivamente identificada como un receptor de membrana con una implicación directa en los procesos de infección por VIH. A partir de aquí, otros trabajos permitieron subrayar la importancia de este receptor en procesos infecciosos que incluían patógenos de todo tipo, ya fueran virus (Ébola), bacterias (M. tuberculosis), hongos (C. albicans) o parásitos (S. mansoni). Desde un punto de vista estructural, es bien sabido que DC-SIGN reconoce e interacciona con diferentes oligosacáridos presentes en la superficie externa de estos agentes patógenos, fundamentalmente aquellos que contienen los monosacáridos D-manosa y L-fucosa. La interacción con D-manosa ha sido ampliamente estudiada a nivel molecular por cristalografía de rayos X, lo cual ha permitido describir con un alto grado de detalle cómo ocurre el reconocimiento de este azúcar y cómo influyen tanto la estructura de la proteína como la del propio oligosacárido en el proceso. En cambio, aunque la interacción de DC-SIGN con L-fucosa ha sido estudiada en paralelo, mucha información existente no está bien justificada desde un punto de vista estructural, lo que ha dificultado en muchos casos la búsqueda de patrones estructurales que permitan entender bien cómo tiene lugar el reconocimiento. Por este motivo, la tesis se ha centrado fundamentalmente en describir desde un punto de vista molecular el reconocimiento de los antigenos de la sangre A y B (que contienen L-fucosa), ya que no hay ningún trabajo precedente que haya descrito esta interacción al detalle. A través de técnicas de Resonancia Magnética Nuclear, se han conseguido modelos 3D precisos de la interacción entre DC-SIGN y ambos antígenos. Además, los modelos propuestos han permitido hacer una comparativa con los antígenos de tipo Lewis, similares en estructura. Se ha podido demostrar que el rol de estabilizar dicha interacción alifática es asumido por otro azúcar (D-galactosa) en el caso de los ligandos aquí estudiados. Al mismo tiempo, se han encontrado diferencias entre los propios antígenos A y B en cuanto al reconocimiento desde un punto de vista dinámico. Los estudios de RMN han revelado que el grupo B, pero no el A, puede unirse a DC-SIGN a través de la D-Gal terminal. Adicionalmente, la selectividad de DC-SIGN se ha estudiado usando técnicas de 19F-RMN con las que se han descifrado los requerimientos estructurales necesarios para que un azúcar simple sea reconocido por DC-SIGN. En el caso de la L-fucosa, se emplearon tres análogos fluorados y se encontró que este monosacárido solo puede ser reconocido a través de una pose concreta. Además, como parte de la tesis y en colaboración con la Universidad de Southampton, se ha desarrollado un proceso de síntesis completamente nuevo para obtener la L-fucosa fluorada en C3, la única cuya síntesis no se había descrito. Finalmente, la tesis también aborda el estudio de dos antígenos de tipo Lewis (LDNF y LDN-DF) que se encuentran en las glicoproteínas del parásito S. mansoni (LDNF y LDN-DF). Se ha observado que el reconocimiento de LDNF tiene lugar de forma similar al del antígeno ¿Lewis X¿. En cambio, el LDN-DF, a pesar de poseer dos fucosas en su estructura, posee una afinidad notablemente baja debido a cómo estos residuos están ordenados en la estructura 3D, lo que hace que la estabilización de los azúcares vecinos desaparezca. Estos resultados destacan una vez más la importancia de disponer de modelos 3D fidedignos para evaluar y predecir los factores geométricos que determinan si la estructura de un oligosacárido es adecuada para su reconocimiento por un receptor biológico.