Multifuncionalización de nanopartículas magnéticas por reconocimiento molecular de ácidos nucleicos y péptidonucleicos para la liberación controlada mediante hipertermia

Zusammenfassung

Desde la década de los 50, debido a sus interesantes propiedades, se están desarrollando estrategias en el diseño de nanopartículas como sistemas portadores de fármacos para aplicaciones terapéuticas. En la actualidad siguen existiendo retos importantes en esta área, como puede ser la capacidad para guiar dichos sistemas in vivo de una manera controlada y obtener efectos terapéuticos precisos. En esta tesis doctoral, el objetivo principal fue el desarrollo de una metodología de liberación controlada de fármacos basada en el uso de nanopartículas magnéticas como sistemas portadores para la liberación controlada de fármacos, ya que estas nanopartículas poseen la propiedad de generar calor bajo la aplicación de un campo magnético alterno mediante la técnica de hipertermia magnética. Dicho trabajo engloba diferentes áreas de investigación como la química, farmacia, ciencia de materiales y estudios celulares in vitro e in vivo. Basándonos en el objetivo principal, cabe destacar el procedimiento de diseño de la plataforma funcional de nanopartículas magnéticas funcionalizadas con hebras de ácidos nucleicos (ADN’) y péptidonucleicos (APN’) que posteriormente son conjugadas mediante puentes de hidrogeno con su hebra complementaría (ADN’’). La formación de estos puentes de hidrogeno favorece la intercalación del fármaco (Dox) minimizando la toxicidad de este, y mediante la aplicación de hipertermia magnética a la plataforma funcional formada, se liberará de forma contralada la Doxorrubicina (Dox). Las nanopartículas magnéticas (MNPs) de 12 nm con morfología esférica en medio orgánico fueron sintetizadas por el método de descomposición térmica de un precursor organometalico (Fe(acac)3), y su estabilización en medio acuoso se llevó a cabo empleando un polímero anfifílico [poli (anhídrido maleico-alt-1-octadeceno) –PMAO]. La hidrólisis de las unidades de anhídrido generó grupos carboxilos orientados hacia el exterior de la capa que recubre la nanopartícula, estabilizándola así en medio acuoso y proporcionando grupos funcionales para posteriores funcionalizaciones. Posteriormente, la funcionalización de las nanopartículas se ha llevado a cabo con un derivado de glucosa (4-aminofenil β-D-glucopiranósido) proporcionando estabilidad coloidal a la plataforma funcional, y con hebras de ADN’/APN’, modificando los porcentajes de estas hebras y las condiciones de reacción. Los resultados demostraron que la proporción optima de la funcionalización con ADN’ y APN’ era (50/50). Su posterior conjugación con su hebra complementaria (ADN’’) marcada con un fluoróforo permitió estimar la cantidad de ADN’/APN’ unida covalentemente a las nanopartículas, además de formar conjugados capaces de albergas el fármaco a transportar. Una vez formada la plataforma funcional, se desarrollaron estudios de la temperatura de desnaturalización de las hebras conjugadas APN’-ADN’’ y ADN’-ADN’’ en disolución, así como las hebras conjugadas APN’-ADN’’ y ADN’-ADN’’ unidas a las MNPs. Los resultados obtenidos nos han permitido evaluar la influencia del tampón (PBS o HEPES 10 mM) utilizado, su concentración, así como de las diferentes longitudes de las cadenas de ADN’’ marcadas con fluoróforo, además de si se encuentran en disolución o unidas a las MNPs. Por lo tanto, el tampón HEPES muestra una mayor liberación de las hebras de ADN’’ complementario, debido a la débil fuerza iónica del tampón, a diferencia del procedimiento de hibridación el cual es mucho más eficaz utilizando PBS. Los posteriores ensayos de liberación mediante calentamiento global (a 37, 50 y 90°C) e hipertermia magnética de la plataforma funcionalizada/hibridada con sus hebras complementarias de ADN’’ demostraron mayores grados de liberación de hebras de ADN’’ complementario al aplicar hipertermia magnética. Los ensayos de liberación mediante hipertermia magnética de la plataforma funcional diseñada se han llevado a cabo manteniendo la temperatura constante en el medio o no y en presencia y ausencia de una hebra de ADN’ de captura de las hebras de ADN’’ complementario liberadas. Los resultados demostraron una mayor liberación de ADN’’ complementario manteniendo la temperatura constante en el medio (37°C) y con la presencia de hebras de ADN’ de captura, siendo dos veces superior si se comparaba con los resultados obtenidos en ausencia de control de temperatura y de hebra de captura de ADN’’. Por último, se estudió el procedimiento de intercalación de doxorrubicina (Dox) en condiciones óptimas de funcionalización ADN’/APN’ (50/50) y su posterior liberación de la plataforma funcional mediante calentamiento global e hipertermia magnética, demostrando una mayor liberación en el segundo caso. Los estudios de liberación de la doxorrubicina calentando a la temperatura de desnaturalización de los conjugados ADN’/ADN’’ y APN’/ADN’’ han demostrado que, a temperatura fisiológica, la liberación del fármaco es mínima. Sin embargo, al aumentar la temperatura se ha observado un incremento de la cantidad de doxorrubicina liberada. Para los ensayos llevados a cabo con hipertermia magnética, se ha observado una mayor liberación del fármaco (Dox) con respecto a la llevada a cabo mediante calentamiento global sin aumentar en exceso la temperatura del medio. La liberación mediante hipertermia magnética, manteniendo o no la temperatura constante del medio, ha puesto de manifiesto el elevado aporte de las propiedades de las MNPs para aumentar la temperatura en la superficie de estas y por tanto obtener mejores resultados. Se ha observado una influencia en la plataforma funcional de la presencia del APN’ en la plataforma, aumentando la inestabilidad de la doxorrubicina en la doble hebra conjugada.