Puesta a punto de técnicas de pcr en heces y de elisa para el diagnóstico de la paratuberculosisestudio de prevalencia en ganado bovino

Resumo

Los dos objetivos que inicialmente se plantearon en este trabajo de Tesis fueron la mejora de las técnicas de diagnóstico de la paratuberculosis en ovino y bovino y su aplicación en un estudio de prevalencia en matadero en ganado bovino. Para ello el grueso del trabajo fue dividido en tres apartados. El primero trató de mejorar el rendimiento de ELISA y de la PCR. Para la mejora de la primera técnica se partió de tres sueros-control positivos de diferente intensidad y uno negativo en la especie ovina, y de uno positivo y otro negativo en la especie bovina. Al mismo tiempo se utilizaron diferentes conjugados marcados con peroxidasa o fosfatasa alcalina forma directa o mediante enlaces intermedios. El objetivo fue encontrar la máxima diferencia entre la respuesta de los sueros control positivo y los de los negativos, lo que se denominó relación respuesta/ruido, de forma que las reacciones inespecíficas fuesen mínimas. Para ello se enfrentaron diluciones seriadas de los sueros control con diluciones de los diferentes conjugados, con lo que se determinó que la mejor relación respuesta/ruido en ganado ovino se obtenía con la dilución de suero 1/600 y el conjugado proteína G peroxidasa a una concentración de 0,025 ug/ml. El ganado vacuno la mayor diferencia entre el positivo y el negativo se obtuvo con la dilución de suero 1/200 y la proteína G peroxidasa a una concentración de 0,05 ug/ml. La mejora del rendimiento de la PCR en heces se abordó mediante la comparación de variantes en el método de concentración de las micobacterias y en la extracción del DNA. Para ello se probaron dos productos dispersantes, el dodecil sulfato sódico (SDS) y el cloruro de hexadecill piridinio (CHP), a concentraciones entre 1,25% y 20%. Posteriormente, el producto de esta concentración se trató mediante ocho protocolos experimentales para la lisis de la pared micobacteriana de tipo químico, enzimático, físico o en combinaciones. Como