Estabilización racional de la apoflavodoxina de anabaena pcc 7119 y estudio de la relevancia de su intermediario de equilibro

Zusammenfassung

Las proteínas en general son muy parecidas desde los puntos de vista químicos, y biofísico, específicamente en algunos de sus procesos fundamentales como son el plegamiento o la interacción con otras moléculas. Esta interacción depende de la estructura de las moléculas implicadas, de sus dinámicas internas y de las fuerzas de interacción, que son las mismas que actúan en el plegamiento. La comprensión en profundidad del plegamiento de las proteínas y de sus procesos de reconocimiento molecular permitirá algún día el cálculo de las estructuras proteicas y de sus complejos lo que facilitará extraordinariamente el estudio integrado de la célula. Existen diversas estrategias racionales usadas para estabilizar la estructura de una proteína basadas en estudios de resultados positivos sobre la estabilidad. En este trabajo analizamos 6 tipos de estrategias de estabilización racional, el relleno de cavidades internas, reemplazamiento de residuos hidrofóbicos expuestos o polares enterrados, optimización de cargas, descarga de puentes de hidrógenos y conservación de secuencias. Para llevar a cabo estas estrategias individualmente o combinadas utilizamos como modelo la apoflavodoxina de Anabaena PCC 7119, la cual ha sido ampliamente empleada en nuestro departamento con estos fines gracias al conocimiento en los últimos años de su estructura tridimensional nativa, así como de su intermediario térmico característico La metodología seguida durante el desarrollo del trabajo de tesis se ha basado en el uso de la mutagénesis dirigida como método específico para la generación de las distintas variantes siguiendo un orden lógico, comenzando por el diseño hasta la caracterización final de cada mutante. El elevado nivel científico presente en este trabajo se ve reflejado en la acumulación de diversas técnicas experimentales como técnicas espectroscópicas de Dicroísmo circular, fluorescencia, absorbancia y técnicas calorimétricas como DSC e ITC. Además, se realizaron análisis por Stopped Flow para la determinación de cinética de plegamiento y unión a ligando, así como cinética de formación de especies intermediarias en el proceso de transferencia de electrones de la flavodoxina con la interacción con la FNR. Se determinó la estructura de un mutante estable de dos estados por cristalografía de rayos X y reemplazamiento molecular, y se analizaron por comparación con la proteína WT mediante dinámica molecular. Se combinaron métodos de análisis de los resultados obtenidos mediante el uso de herramientas informáticas lo que ha permitido dar respuestas a las hipótesis y objetivos planteados durante el desarrollo del mismo. Logramos durante el desarrollo de este trabajo aplicando técnicas racionales de termoestabilización a proteínas compleja transformar una proteína de tres estados en una de dos aplicando combinación de mutaciones sobre la región menos estables de la flavodoxina de Anabaena PCC 7119. Como resultado se obtuvieron variantes con una estabilidad muy superior a la proteína silvestre, hasta 32 grados más termoestable respecto a la temperatura de la primera transición de la WT. Este hecho reflejó el aumento de manera considerable de la estabilidad relevante de los mutantes desapareciendo el intermediario de equilibrio. Esto nos dio la oportunidad de estudiar el papel del intermediario en la función fisiológica de la proteína silvestre por la comparación entre ambas. Los análisis del comportamiento de ambas proteínas (variante estable de dos estados y silvestre) a lo largo de la vía que conduce a la formación de una proteína funcional final mostró que la variante estable 6M se pliega similar a la WT con un desplegamiento 30 veces menor de acorde con su elevada estabilidad térmica. Mantuvo afinidad por el FMN, aunque algo menor, y la velocidad de unión fue 6 veces menor que la WT. Los valores de potenciales de óxido-reducción fueron diferentes observándose una menor estabilización de semiquinona, no obstante, el proceso global de la semireducción del FMN ocurrió similar entre ambas. La variante 6M interaccionó con la su pareja fisiológica (FNR) con la misma afinidad que la proteína WT y el proceso de transferencia de electrones fue similar de eficiente que el observado para la proteína silvestre. Finalmente, las estructuras fueron muy similares con ligeras diferencias. El mutante 6M fue ligeramente más compacto que la proteína WT. De los análisis se demostró que la presencia del intermediario térmico de equilibrio de la apoflavodoxina de Anabaena PCC 7119, no participa a lo largo de la vía de formación de la proteína funcional, ni es importante para la función fisiológica esta proteína, de transferir electrones a nivel de la membrana de la cianobacteria.