Inmunidad innata frente a lentivirus de pequeños rumiantes (SRLV)papel de TRIM5

Zusammenfassung

Los lentivirus de pequeños rumiantes (SRLV) incluyen el virus Visna/Maedi (VMV) y el virus de la artritis encefalitis caprina (CAEV) e infectan a las especies ovina y caprina, originando una inflamación multisistémica que causa distintos tipos de enfermedad (mastitis, artritis, neumonía y/o encefalitis) que pueden terminar con la vida del animal. El descenso de productividad en los rebaños que presentan infección por SRLV junto con el aumento de mortalidad causado por infecciones secundarias y al desvieje prematuro de los animales infectados produce un aumento de la tasa de reposición en el rebaño y grandes pérdidas económicas. Asimismo, la exportación de ganado a otros países se ve afectada, ya que cada vez más se exige la certificación de la ausencia de virus o de patologías asociadas a la infección por SRLV en el rebaño. Por estas razones, desciende el valor de los rebaños infectados y aumenta el valor añadido de los rebaños certificados libres de SRLV. Las medidas actuales de control contra los SRLV basadas en la detección serológica y la eliminación de los animales infectados, distan mucho de ser definitivas para erradicar la infección por SRLV. Además, debido a los múltiples saltos de especie descritos en la literatura entre ovinos, caprinos y algunos miembros de la fauna silvestre, los SRLV podrían aumentar su heterogeneidad antigénica, dificultando o imposibilitando el diagnóstico serológico con las herramientas disponibles. Además, el receptor o receptores celulares de los SRLV se encuentran en diversos tipos celulares de diferentes especies, como la humana pero no todas las especies se infectan por SRLV, lo que sugiere que existe una restricción de la infección posterior a la entrada del virus en la célula. Por otro lado, varios estudios han intentado desarrollar una vacuna frente a SRLV con éxitos parciales. Pero actualmente no existen vacunas altamente eficaces que no induzcan a su vez respuestas inflamatorias, lo que puede llevar a una confusión entre la respuesta a la vacunación y la aparición de lesiones propias de la enfermedad. Finalmente, no existen tratamientos eficaces frente a este tipo de infecciones. Por todo ello, el estudio de factores de restricción de la inmunidad innata puede significar una alternativa eficaz para el tratamiento o prevención de las infecciones por SRLV. Los factores de restricción son proteínas antivirales expresadas constitutivamente en ciertos tipos celulares que inhiben el ciclo vital viral. Éstos reconocen e inhiben la infección de retrovirus, generalmente con mayor potencia cuando son divergentes, es decir, proceden de una especie heteróloga; presentan una tasa de evolución inusual en la secuencia aminoacídica como consecuencia de la coevolución con el virus antagonista y, como contrapartida, el virus se adapta y evade la unión a estos factores de restricción, o bien, antagoniza su acción mediante proteínas virales accesorias. TRIM5¿ es uno de los factores de restricción que más se ha estudiado, ya que podría utilizarse como tratamiento o prevención de las enfermedades lentivirales. TRIM5 pertenece a la familia TRIM que se caracteriza por contener los dominios RING, B-Box2, Coiled-coil, además de un dominio PRYSPRY carboxilo terminal más variable, responsable de la especificidad de la diana viral. El mecanismo de acción de TRIM5 no se conoce en profundidad pero se admite que éste se une a la cápside vírica mediante su dominio PRYSPRY y por un mecanismo que parece implicar al proteasoma, la cápside vírica se rompe y se impide la infección ya que el virus no se llega a integrar en el genoma de la célula. Una mayor comprensión de la restricción ejercida por TRIM5 y de su mecanismo de acción es esencial para generar un tratamiento eficaz contra las infecciones lentivirales. Para ello, en esta tesis se llevaron a cabo los siguientes objetivos: a) Identificación y caracterización de TRIM5 en las especies ovina y caprina. b) Determinación del posible papel restrictivo de TRIM5¿ ovino en la infección por SRLV. c) Exploración de la restricción mediada por TRIM5¿ ovino y caprino en la infección por retrovirus heterólogos y su posible papel como barrera para la propagación de los virus entre especies. d) Investigación, mediante análisis filogenéticos, de las tasas evolutivas y la posible coevolución entre SRLV y TRIM5 de rumiantes domésticos y silvestres. a) Identificación y caracterización de TRIM5 en las especies ovina y caprina: Se analizaron las secuencias de TRIM5 ovino y caprino y se vio que presentaban una alta similitud. Sin embargo, el dominio PRYSPRY es el que presenta mayor heterogeneidad aunque menor de la esperada tratándose de dos especies diferentes. Además, las secuencias presentan diversidad intraespecie a excepción de las que provienen de cabras de la raza Roccaverano que resultaron ser más homogéneas. Filogenéticamente, todas se encuentran en un nuevo cluster de TRIM5 de pequeños rumiantes junto a TRIM5 de bovino. Además, se secuenciaron cDNAs que pueden dar lugar a una isoforma más corta de TRIM5, muy parecida a TRIM5¿ en humanos. b) Determinación del posible papel restrictivo de TRIM5¿ ovino y caprino en la infección por SRLV: Se transdujeron células murinas MDTF con vectores retrovirales para que expresasen TRIM5 ovino de forma estable. Esas células se infectaron con la estirpe Ev1 del VMV y a las 16 h post-infección se extrajo el DNA y se cuantificó la cantidad de DNA viral mediante PCR cuantitativa (qPCR). TRIM5 ovino restringe la producción de DNA viral. Además, se inhibió el proteasoma en dichas células con un inhibidor químico, y de esta forma se recuperaba la síntesis de DNA viral, sugiriendo un mecanismo de acción de TRIM5 conservado entre especies. c) Exploración de la restricción mediada por TRIM5¿ ovino y caprino en la infección por retrovirus heterólogos: Se infectaron fibroblastos de piel ovina que expresan TRIM5 ovino de forma natural con una batería de vectores retrovirales (HIV-1 y 2, SIV, MLV-N y MLV-B) y se vio que dichos fibroblastos restringen la infección por HIV-2. Para comprobar que esta restricción era debida a TRIM5, se transdujeron células murinas MDTF con retrovirus pseudotipados para que expresasen de forma estable las secuencias de TRIM5¿ ovino Ov1 u Ov2, ambas procedentes de fibroblastos ovinos. Las células transducidas con la secuencia Ov2 restringen la infección por HIV-2 y HIV-1. Sin embargo, cuando estas células expresan la secuencia Ov1, que difiere en un sólo aminoácido de la secuencia Ov2 (E339K), no restringen la infección por ninguno de los virus testados. No obstante, cuando la secuencia Ov2 de TRIM5 ovino se expresa de forma estable en células caprinas GSM-T pierde la capacidad de restricción, probablemente por interferencia con el TRIM5 caprino que expresan las GSM-T de forma natural. De forma similar, las células caprinas GSM-T que expresan TRIM5 caprino de forma natural restringen la infección por SIV y MLV-N. Para comprobar que esta restricción se debía a TRIM5, se generaron células murinas MDTF que de forma estable expresan TRIM5 caprino mediante transducción con retrovirus pseudotipados. Estas células restringieron la infección por SIV pero no por MLV-N, indicando que la restricción de SIV es debida a TRIM5 pero la restricción de MLV-N no es debida a TRIM5 o necesita un cofactor que no está presente en las células MDTF. d) Investigación, mediante análisis filogenéticos, de las tasas evolutivas y la posible coevolución entre SRLV y TRIM5 de rumiantes domésticos y silvestres: Se obtuvieron secuencias de TRIM5 completo procedentes de muestras de cabras y ovejas a partir de RNA. Además, se obtuvieron secuencias del dominio PRYSPRY (exón 8) a partir de DNA de ciervos para comparar con las secuencias obtenidas a partir de pequeños rumiantes. Se compararon las secuencias a diferentes niveles. El alineamiento aminoacídico reveló diferencias tanto en los dominios RBCC como en el PRYSPRY indistintamente. Sin embargo, la mayoría de los codones seleccionados bajo selección positiva se encontraban principalmente en el dominio PRYSPRY. Para evaluar la presencia de selección positiva se usaron diferentes métodos Single Likelihood Ancestor Counting (SLAC), Fixed Effects Likelihood (FEL), Random Effects Likelihood (REL), Mixed Effects Model of Evolution (MEME) y Fast Unbiased Bayesian Approximation Analysis (FUBAR). De entre ellos FEL resultó ser más indicativo ya que los codones seleccionados por este método, también lo fueron por al menos tres del resto. Siguiendo este análisis se identificaron al menos 4 codones, dos en el dominio RING y dos en el PRYSPRY que podrían ser candidatos a interactuar con determinantes virales. Aunque la topología del árbol generado sugiere que la evolución de TRIM5 en ciervos es paralela a la de los pequeños rumiantes, algunos codones seleccionados positivamente coinciden entre ambos y la estructura de la proteína muestra zonas similares a la de pequeños rumiantes por lo que no podemos descartar la presencia actual o ancestral de lentivirus relacionados en pequeños rumiantes y ciervos.