Unravelling the physiological origin of oxidized nitrogen species in plants

Resum

RESUMEN Desde su descubrimiento como molécula activa en los sistemas biológicos 25 años atrás, el estudio del óxido nítrico (NO) ha sido de gran interés en el campo biomédico. A lo largo de la pasada década también ha ido ganando una considerable relevancia en el campo de la biología vegetal, pero aún existen numerosos huecos inexplorados sobre su fisiología que deben ser considerados. Hoy día, la relevancia del NO como segundo mensajero en una gran variedad de funciones fisiológicas es indiscutible. Sin embargo, su naturaleza dual por un lado como molecula señalizadora esencial, y por otro como responsable de varias modificaciones post-traduccionales en proteínas, lípidos y ácidos nucleicos que conducen en última instancia al daño celular, aún es poco conocida. El óxido nítrico tiene la capacidad de reaccionar con el radical superóxido (O2-), generando peroxinitrito (ONOO-). Este anión es un potente oxidante capaz de nitrar péptidos y proteínas en el grupo fenilo de los residuos de tirosina, fenómeno que se conoce comúnmente como nitración de tirosinas. Alternativamente, se ha propuesto otra vía por la cual el NO puede expresar su citotoxicidad. La implicación de ciertas peroxidasas y otras hemoproteínas en la catálisis de la nitración de tirosinas ha sido descrita en numerosas publicaciones. Esto constató una vez más la importancia del Fe y del grupo hemo en los procesos de degeneración celular. La modificación reversible de proteínas mediante la adición de un grupo nitro (-NO2) puede desembocar en la modificación de la conformación y la estructura y en última instancia provocar su inactivación. En plantas, la consideración de proteínas nitradas como marcadores de estrés nitrativo es una cuestión relativamente novedosa, mientras que en animales está ampliamente aceptado desde hace años. El estudio de RNS in vivo, sin embargo, es particularmente difícil de llevar a cabo tanto en sistemas animales como vegetales debido a su corta vida media y las bajas concentraciones a las que son producidas in vivo. Por tanto, son necesarias nuevas aproximaciones para la detección y modulación de ONOO-. Con este objetivo, se desarrolló un bioensayo para la detección de ONOO- usando una proteína vegetal recombinante, la Fe-superóxido dismutasa de cowpea (rVuFeSOD) que había sido previamente aislada del citosol del nódulo, como molécula diana para la nitración de tirosinas. Con el propósito de generar nitración, se testaron dos métodos. En primer lugar se usó un compuesto artificial denominado SIN-1, que libera de manera simultánea NO y O2- en condiciones fisiológicas. Por otro lado, como modelo de nitración alternativo se utilizó peróxido de hidrógeno (H2O2), nitrito (NO2-) y Fe catalítico. Los dos modelos resultaron efectivos a la hora de provocar nitración de tirosinas, la cual fue detectada bien immunoquímicamente utilizando un anticuerpo anti-3-nitrotirosina, o bien de manera indirecta mediante la estimación de la pérdida de la actividad enzimática en la rVuFeSOD. El Fe resultó tener un papel determinante en ambos sistemas. El estudio de las interacciones entre las RNS y las Fe-proteínas es una parte importante de la química del NO y de las especies de N oxidado en sistemas biológicos. El hecho de que la rVuFeSOD fuera una proteína que contenía Fe y que se hubiera descrito como moduladora de la química de las RNS también fue significativo para el trabajo con esta enzima, aislada de los nódulos de cowpea (Vigna unguiculata). La hipotética modulación de la nitración que algunos compuestos antioxidantes y hemoglobinas (Hbs) vegetales eran capaces de ejercer podía estudiarse in vitro utilizando la rVuFeSOD como diana del SIN-1. Como novedad, se observó que no sólo las Hbs no-simbióticas eran susceptibles de nitrarse, sino que también las leghemoglobinas lo hacían. De los ensayos con la rVuFeSOD, se concluyó que las Hbs vegetales lograban ejercer una función protectora frente a las RNS, ya fuese por su eliminación del NO o por el hecho de ser objetivo directo del ataque nitrativo. Ciertos compuestos presentes en los nódulos de leguminosas prevenían contra la nitración in vitro, siendo el ascorbato el compuesto estudiado más efectivo, ya que en su presencia la actividad catalítica de la rVuFeSOD mejora notablemente incluso estando expuesta al ONOO-. A pesar de tener una funcionalidad esencial y bien reconocida en plantas, todavía hay una falta importante de conocimiento y controversia sobre muchas de las reacciones que conllevan a la formación de NO en la célula vegetal. La reacción de reducción del nitrito para formar NO ha sido sin duda la estudiada con mayor minuciosidad, no sólo a nivel fisiológico o bioquímico, sino también en el plano genómico y de regulación post-traduccional de las enzimas. En lo que concierne a la producción oxidativa de NO, la existencia de una óxido nítrico sintasa (NOS) vegetal similar a la de mamíferos aún no ha sido probada. Se han descrito actividades tipo NOS en diversas especies vegetales desde 1996; sin embargo, después de numerosas publicaciones controvertidas e investigaciones exhaustivas no se ha conseguido identificar genes homólogos para la NOS animal en el genoma de ninguna planta. Estudios recientes demostraron que las células vegetales tenían la capacidad de oxidar hidroxilaminas aplicadas exógenamente y emitir NO, y dicha reacción parecía acelerarse en presencia de ROS. Después de recabar más información relacionada con este tema y comprobar que las plantas eran capaces de completar su ciclo vital utilizando amonio (NH4+) como única fuente de N, se lanzó la hipótesis de la posible existencia de reacciones oxidativas de nitrificación en plantas, similares a aquellas que tienen lugar en ciertos microorganismos. En esta supuesta vía, el NH4+ se oxidaría a nitrato (NO3-) pasando por una serie de intermediarios nitrogenados como podían ser la hidroxilamina (HA), el NO o el nitrito (NO2-), entre otros. La producción oxidativa de NO3- en plantas bajo nutrición amoniacal se caracterizó en diversas especies vegetales, las cuales fueron crecidas en cultivo axénico utilizando el amonio como la única fuente de N para la planta. Todos los tejidos vegetales analizados contenían NO3- en el rango micromolar. El modelo de crecimiento in vitro permitió descartar que las especies de N oxidado producidas no eran de origen vegetal. Las plantas crecidas en hidropónico con NH4+ como única fuente de N también emitían NO, aunque en tasas muy bajas y sólo en condiciones de hipoxia, lo que sugería que la fuente de NO era probablemente la nitrato reductasa NR, pero el NO2- o el NO3- reducidos por esta enzima debían haber sido previamente generados de manera oxidativa. Cuando estas mismas plantas de guisante fueron tratadas con el generador de O2- metil viológeno, las emisiones de NO incrementaron acusadamente así como los contenidos de NO2- y NO3- tanto en hojas como en raíces. Una vez más, las emisiones de NO no podían atribuirse a la producción desde HA sino al aumento de N oxidado por las ROS. No obstante, esto evidenciaba el efecto positivo que tenían las ROS en la oxidación de NH4+. A nivel de orgánulo, las mitocondrias no parecían estar relacionadas con la oxidación de NH4+ inducida por ROS tal y como se mostró en ensayos llevados a cabo con mitocondrias aisladas de raíz de guisante.