Functionalized mesoporous titania film coatings for bone implants with antibacterial and enhanced osseointegrative properties

Résumé

Cada vez hay más cepas bacterianas resistentes a antibióticos y su presencia en entornos médicos supone un riesgo cuando los pacientes son sometidos a una intervención quirúrgica. Cuando una persona es sometida a una cirugía para la sustitución de un hueso por un implante hay riesgo de desarrollar una infección nosocomial y no conseguir una buena osteointegración del implante. En estos casos, es necesario realizar una segunda cirugía para evitar la proliferación de la infección en la zona donde se sitúa el implante, siendo necesaria su sustitución.En la actualidad, para evitar infecciones se suministran antibióticos oralmente; su mayor desventaja es que la concentración que llega a la zona deseada, en este caso el implante, es baja, y en muchos casos no es lo suficientemente alta para evitar la proliferación bacteriana. En este marco surge la necesidad de desarrollar recubrimientos antibacterianos efectivos. Hay dos rutas principales para conseguir una buena osteointegración del implante; (I) evitar la proliferación bacteriana empleando superficies antibacterianas, esta sería la forma más directa, y (II) se puede evitar de una manera indirecta la infección mejorando la adhesión de pre-osteoblastos al implante, lo que hará que se forme la cápsula protectora más rápidamente evitando así la proliferación bacteriana y consiguiendo una rápida proliferación y diferenciación celular.Esta tesis presenta diferentes métodos de funcionalización de películas de titania mesoporosa mediante el uso de antibióticos y factores de crecimiento. Es posible incorporar antibióticos directamente, por inmersión, o también se pueden formar complejos con el antibiótico y ensamblar una película basada en multicapas de polielectrolitos (PEM, por sus siglas en inglés). Los iones bioactivos pueden estimular procesos celulares como la proliferación y diferenciación en pre-osteoblastos. Estos iones se pueden incorporar a la matriz de titania o complejarse en las paredes de la película mesoporosa que se ha funcionalizado previamente con grupos carboxilo. En el Capítulo 1, se utilizan películas mesosporosas de titania para encapsular y liberar controladamente gentamicina. La superficie mesoporosa se funcionaliza con la proteína morfogenética ósea recombinante humana 2 (rhBMP-2, por sus siglas en inglés). La gentamicina es un antibiótico de amplio espectro que se emplea en infecciones seriasque han podido ser causadas tanto por bacterias gram negativas como positivas; como P. aureginosa, E. coli o citrobacter, Estreptococos o Estafilococos. La gentamicina es un aminoglucósido y por tanto su mecanismo de acción consiste en unirse al ARN ribosomal de la subunidad 30S de los ribosomas bacterianos, interfiriendo así en la síntesis proteica. La rhBMP-2 es una proteína ósea, y se ha demostrado que promueve la formación ósea y se emplea para reconstruir defectos óseos patológicos. Las películas se sintetizan mediante recubrimiento por centrifugación sobre cubreobjetos de vidrio a través del método de autoensamblaje inducido por evaporación (EISA, por sus siglas en inglés). La película obtenida tiene un espesor de 80 nm con poros de 5.7 nm de diámetro conectados por cuellos de 4.2 nm de diámetro. Muestran una porosidad del 30.7 %, obtenida por Porosimetría Elipsométrica Ambiental (EEP, por sus siglas en inglés). El módulo de elasticidad de las películas se midió por nanoindentación, resultando tener un valor de 25,5 ± 5 GPa, lo que hace que la superficie sea óptima para su uso en implantes óseos. A pesar de que las superficies de titania densa muestran un módulo de elasticidad en el rango de 100 a 120 GPa, mayor que el de películas mesoporosas de titania, el módulo elástico del hueso varía entre 4 y 30 GPa, donde se encuentra el valor de las películas mesoporosas.La gentamicina se incorpora en los poros por inmersión, mientras que la rhBMP-2 se adsorbe electrostáticamente sobre la superficie de la película. Mediante medidas de ángulo de contacto y Espectroscopía Fotoelectrónica de Rayos-X (XPS, por sus siglas en inglés) se prueba la presencia de gentamicina y rhBMP-2. Se observa que la liberación de la gentamicina del interior de los poros de la película ocurre en dos fases; al inicio un 36 % de la gentamicina encapsulada se libera rápidamente, seguida por una segunda fase que ocurre más prolongadamente y que dura semanas. Este perfil de liberación resulta óptimo en implantes óseos donde es necesaria una alta concentración de antibiótico durante la cirugía y en las horas posteriores, viéndose necesaria su disminución cuando el tejido óseo se está formando. Las películas en base a titania funcionalizadas con gentamicina y rhBMP-2 han resultado ser eficaces contra la colonización por S. aureus. Cuando se sembraron 1,000 unidades formadoras de colonias (UFC), éstas no proliferaron, demostrando la eficacia de la gentamicina que se libera del interior poroso de la película. La presencia de rhBMP-2 mejora la adhesión celular, evaluada con la líneacelular pre-osteoblástica MC3T3-E1, lo que contrarresta el efecto que la gentamicina tiene en la proliferación y diferenciación celular. Después de 10 días de cultivo en medio osteogénico la diferenciación celular es el doble si se compara con películas mesporosas no funcionalizadas. En el Capítulo 2, se fabrican multicapas en base a poli-L-lisina (PLL) y complejos de ácido poli(acrílico) (PAA) y gentamicina mediante la técnica de ensamblado capa por capa (LbL, por sus siglas en inglés). La técnica LbL consiste en la adsorción sucesiva de polielectrolitos con carga opuesta mediante interacciones electrostáticas. La multicapa se fabrica sobre películas mesoporosas de titania. Los complejos se preparan mezclando PAA y gentamicina en 500 mM NaCl a pH 4.5 con el objetivo de obtener complejos de tamaño estable. Se necesitan aproximadamente 2 h para fabricar la multicapa, y los complejos se estabilizan durante 2 h, después de mezclar el PAA con la gentamicina. Una vez han transcurrido estas 2 h se comienza a fabricar la multicapa. El tamaño de los complejos se mantiene estable durante la formación de la multicapa con un tamaño alrededor de 300 nm de diámetro. El ensamblado del PLL y los complejos sigue un crecimiento exponencial, observado cuando el ensamblado es monitoreado en la Microbalanza de Cristal de Cuarzo con monitoreo de la disipación (QCM-D, por sus siglas en ingles), permitiendo una alta carga de gentamicina en una PEM de únicamente 4 capas. Las imágenes de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM, por sus siglas en ingles) y Microscopía de Fuerza Atómica (AFM, por sus siglas en inglés) demuestran que la superficie del ensamblado es irregular, lo que unido al crecimiento exponencial observado por QCM-D, da lugar a asociar este tipo de crecimiento a un crecimiento por ¿islas¿ descrito previamente en otros trabajos. Hasta pH 13 la PEM es estable, sin embargo, a pH fisiológico la gentamicina se libera. El 48 % de la gentamicina total es liberada en las 6 primeras horas, dando lugar después a una liberación paulatina del 80 % que dura más de un mes.Para estudiar la actividad de la gentamicina liberada de la multicapa se siembran 1,000 UFC de S. aureus sobre las multicapas y sobre los sustratos control, que consisten en cubreobjetos de vidrio sumergidos en gentamicina. Se incuban las bacterias durante 24 h y posteriormente se despegan las que se han adherido y se siembran sobre placas de agar, para proceder al conteo visual de las UFC después de dejarlas crecer una noche(aproximadamente 18 h). Las multicapas sintetizadas son eficaces para prevenir la proliferación de la S. aureus, en comparación con el control, la cantidad de bacterias que crecen sobre la multicapa son 3 órdenes de magnitud inferior. En el Capítulo 3, se preparan películas mesoporosas de titanato de estroncio (SrTiMFs) con un 30 % de volumen poroso y un contenido molar de estroncio (Sr) del 20 %. Las películas presentan un diámetro de poro de 5,5 nm conectados por cuellos de 3,2 nm y tienen un espesor de 85 nm. Los SrTiMFs muestran una gran área superficial interna disponible para el intercambio de Sr. Los espectros obtenidos en diferentes zonas de la película por Microscopía Electrónica de Barrido por Transmisión (STEM, por sus siglas en inglés) han demostrado que el Sr se encuentra distribuido homogéneamente en la estructura de titania y no se observan agregados o islas de Sr. La liberación del estroncio se monitorea mediante mediciones de Espectrometría de Masas de Plasma Acoplado Inductivamente (ICP-MS, por sus siglas en inglés). Los resultados indican que en las 8 primeras horas el 44 % del Sr que contenía la película es liberado al medio celular. Después de las 8 horas, se observa que más Sr se libera, pero en cantidades inferiores, y debido a que no se ha liberado el 100 % se espera que haya una liberación más lenta y paulatina. Los SrTiMFs mejoran la adhesión de pre-osteoblastos mostrando una mayor filopodia, se observa que las células están más alargadas, si se compara con células cultivadas sobre sustratos de titania que no contienen estroncio. Las tasas de proliferación y diferenciación celular también mejoran gracias a la presencia de estroncio. En general, la incorporación de Sr en los recubrimientos de titania mesoporosa puede dar lugar a una más pronta osteointegración en las etapas tempranas de formación de tejido óseo. En el segundo día, la proliferación celular es en un 64% mayor, comparada con la proliferación celular sobre sustratos sin estroncio, y la actividad de la alcalina fosfatasa también es mayor después del quinto día de cultivo en medio osteogénico. En el Capítulo 4, se sintetizan películas híbridas de sílice inorgánica-orgánica mesoporosa y de titania con grupos funcionales de ácido carboxílico covalentemente unido a las paredes de los poros. Las películas de sílice se fabrican en un solo paso utilizando alcoxisilanos derivados de ácidos carboxílicos obtenidos mediante la reacción clic de adición radicalaria tiol-eno iniciada fotoquímicamente (PRTEA, por sus siglas en inglés).Los organosilanos se preparan mediante una reacción clic entre tioácidos mercaptosuccínicos (MSA, por sus siglas en inglés) o mercaptoacéticos (MAA, por sus siglas en inglés) y el viniltrimetoxisilano (VTMS, por sus siglas en inglés). Las películas se sintetizan mediante EISA a partir de una solución que contiene una mezcla de tetraetoxisilano y diferentes cantidades de organosilanos. Las películas de titania se obtienen en dos pasos; el sol se prepara mezclando VTMS y el precursor de Ti, y después de la síntesis de la película, se somete la película a una reacción fotoquímica con MSA para incorporar los grupos carboxilo en la superficie porosa de la película. Las películas se caracterizan mediante microscopía electrónica, mediciones de porosimetría y Dispersión de Rayos-X de Ángulo Pequeño con detección bidimensional (2D-SAXS, por sus siglas en inglés). El grado de ordenamiento de las películas de sílice depende de la cantidad de organosilano agregado en la síntesis. La incorporación de los grupos vinilo y carboxilo funcionales se muestra mediante XPS, y la presencia de los grupos COOH se confirma mediante Espectroscopia de Transformada de Fourier de Infrarrojo por Reflectancia Difusa (DRIFTS, por sus siglas en inglés). La disponibilidad de los grupos COOH para la modificación química se demuestra mediante DRIFTS siguiendo los cambios en las bandas IR típicas de carbonilo durante el intercambio de protones y la complejación de metales. Para películas de sílice se estudia la complejación de Pb2 +, y para películas de titania Sr2 +. La liberación del estroncio se estudia por ICP-MS, mostrando una liberación prolongada de Sr que dura una semana, beneficiando así los procesos de diferenciación y proliferación de pre-osteoblastos. Se observa una mejora en la proliferación a 3 día de cultivo y la diferenciación celular se mejora después de 15 días de cultivo en medio osteogénico. Estos resultados se obtienen comparando con la proliferación y la diferenciación celular sobre películas de titania mesoporosa sumergidos en SrCl2. Este capítulo muestra la posibilidad de sintetizar películas mesoporosas con grupos funcionales disponibles para la complejación de iones bioactivos, como pueden ser el magnesio o el calcio, que también ayudan en procesos celulares relacionados con la regeneración de hueso. En general, se ha demostrado la versatilidad de las películas mesoporosas de titania para mejorar la osteointegración y evitar la proliferación bacteriana. Los materialesmesoporosos son muy versátiles siendo posible modificar la estructura mesoporosa y la orientación de los poros cambiando el surfactante empleado para la síntesis. También se puede modificar el espesor cambiando los parámetros de velocidad de centrifugación o inmersión y, por último, también es posible sintetizar películas híbridas mesoporosas, pudiendo obtenerse así películas con diversas funcionalidades. Modificando la síntesis de las películas mesoporosas, varía la concentración de moléculas que quedan atrapadas en el interior de la estructura porosa. Además, el área superficial interna disponible para el intercambio iónico también se puede ampliar.