La actividad nitrato reductasa en phormidium laminosumregulación, purificación y caracterización

Résumé

LOS NIVELES DE ACTIVIDAD NITRATO REDUCTASA (NR) DE LA CIANOBACTERIA TERMOFILA PHORMIDIUM LAMINOSUM ESTAN REGULADOS POR LA DISPONIBILIDAD DE CARBONO Y LUZ. DICHA REGULACION SE BASA EN EL CONTROL DE LA SINTESIS DEL ENZIMA, LA CUAL TIENE LUGAR EN MEDIO DE CULTIVO CON NITRATO O NITRITO Y TAMBIEN EN AUSENCIA DE FUENTE DE NITROGENO Y SE INHIBE EN PRESENCIA DE AMONIO, EN AUSENCIA DE FUENTE DE CARBONO Y EN OSCURIDAD. LA AUSENCIA PROLONGADA DE FUENTE DE NITROGENO DA LUGAR A UN GRAN INCREMENTO (10-15 VECES) DE LA ACTIVIDAD ESPECIFICA NR, QUE SE TRADUCE EN UNA INTENSA EXCRECION DE NITRITO CUANDO, POSTERIORMENTE, SE SUMINISTRA NITRATO, LO CUAL PUEDE CONFERIR UNA VENTAJA COMPETITIVA ANTE LA LIMITACION DE NITROGENO DEBIDO AL EFECTO NOCIVO DEL NITRITO EN MUCHOS MICROORGANISMOS. A CAUSA DE LA ESCASA ACTIVIDAD NR DE P.LAMINOSUM EN MEDIO CON NITRATO, SE HAN UTILIZADO PARA ESTABLECER UN PROCEDIMIENTO DE PURIFICACION DEL ENZIMA, CULTIVOS SOMETIDOS A DEFICIENCIA EN NITROGENO. ESTE PROCEDIMIENTO CONSTA DE 10 ETAPAS Y PERMITE PURIFICAR LA NR 8800 VECES CON UN RENDIMIENTO DEL 22%. UTILIZANDO EL MISMO PROCEDIMIENTO CON CELULAS CRECIDAS CON NITRATO EL ENZIMA SE HA PURIFICADO MAS DE 115000 VECES CON UN RENDIMIENTO DEL 35%. LA NR MUESTRA UNA ACUSADA INESTABILIDAD Y UN COMPORTAMIENTO COMPLEJO EN ELECTROFORESIS NATIVA DETECTANDOSE ESTADOS DE AGREGACION Y POSIBLES FORMAS IONICAS Y/O CONFORMACIONALES DISTINTAS. SIN EMBARGO, A PARTIR DE AMBAS FUENTES EN ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE CON SDS, RINDE, REVELANDO CON PLATA, UNA UNICA BANDA DE 58 KD UNA MASA MOLECULAR SIMILAR SE HA CALCULADO POR FILTRACION EN GEL. EL ENZIMA PURIFICADO A PARTIR DE CULTIVOS DEFICIENTES EN NITROGENO SE HA CARACTERIZADO ATENDIENDO A SUS PROPIEDADES CINETICAS Y CATALITICAS MAS IMPORTANTES UTILIZANDO EL ENSAYO DE ACTIVIDAD DEPENDIENTE DE METILVIOLOGENO REDUCIDO CON AITIONITO Y TAMBIEN EL DEPENDIENTE DE FERREDOXINA REDUCIDA, SU DONADOR FISIOLOGICO DE ELECTRONES. ASIMISMO SE HA