Lentiviral mediated selection of midbrain dopamine neurons derived from pluripotent cells based on the expression of the forkhead transcription factor foxa2

Résumé

La enfermedad de Parkinson se caracteriza por la degeneración y muerte selectiva de las neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra (Aguila et al., 2012). La pérdida de esta población celular trae como consecuencia un déficit de dopamina en el estriado generando los trastornos motores característicos de la enfermedad tales como temblor, rigidez, bradicinesia, entre otros (Aguila et al., 2012). La terapia celular basada en trasplantes de tejido mesencefálico ha sido empleada en la enfermedad de Parkinson (Mendez et al., 2008, Lindvall and Bjorklund, 2011). Algunos de los pacientes trasplantados han mostrado una mejoría considerable de los síntomas motores (Kefalopoulou et al., 2013), sin embargo la poca disponibilidad de esta fuente celular y los aspectos éticos asociados a su uso constituyen una limitación importante. Adicionalmente, pacientes trasplantados con esta fuente celular han manifestado complicaciones motoras conocidas como discinesias inducidas por el trasplante (GID, de sus siglas en ingles); frecuentemente relacionado con la presencia de neuronas serotonérgicas (Brundin et al., 2010, Aguila et al., 2012). Esto evidencia la escasa estandarización del tejido mesencefálico a trasplantar y una composición celular heterogénea donde solo alrededor de un 5 % representa neuronas dopaminérgicas (Silani et al., 1994, Brundin et al., 2010, Aguila et al., 2012).Las células pluripotentes, por su capacidad de autorenovación y potencialidad para dar lugar a cualquier tipo celular son una fuente atractiva e ilimitada, al menos en teoría. Sin embargo, estas propiedades también complican la posibilidad de generar in vitro una población celular homogénea. El establecimiento de protocolos de diferenciación dopaminérgica a partir de fuentes pluripotentes y su capacidad para2integrarse y revertir síntomas motores en distintos modelos de Parkinson ha generado gran expectativa con vistas a su posible aplicación clínica (Lee et al., 2000, Hedlund et al., 2008, Sanchez-Pernaute et al., 2008, Kriks et al., 2011, Ganat et al., 2012, Xi et al., 2012). Sin embargo, su empleo en la medicina regenerativa está condicionada a la capacidad para desarrollar protocolos de diferenciación más eficientes en combinación con métodos de selección (Pruszak et al., 2007, Hedlund et al., 2008, Aguila et al., 2012, Ganat et al., 2012).En este sentido, el trabajo realizado en esta tesis se ha dirigido a desarrollar una estrategia de selección de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas derivadas de fuentes pluripotentes basada en la expresión de Foxa2. Este marcador es un factor de transcripción expresado por las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas de forma temprana durante el desarrollo embrionario y juega un papel esencial en su especificación y diferenciación (Ferri et al., 2007, Kittappa et al., 2007). Su expresión, restringida a este grupo de neuronas dopaminérgicas, se mantiene durante el desarrollo en el adulto regulando su identidad y supervivencia (Kittappa et al., 2007, Stott et al., 2013).Para la selección de neuronas de neuronas dopaminérgicas mesencefálicas derivadas de fuentes pluripotentes, hemos desarrollado vectores lentivirales que expresan diferentes reporteros controlados por dos secuencias promotoras del gen de Foxa2. Una de las secuencias reguladoras incluye el promotor de 400pb del gen Foxa2 y la otra secuencia contiene adicionalmente 1200pb del primer intrón y exón (no codificantes). Para comprobar la especificidad de estos vectores utilizamos líneas celulares humanas y murinas con expresión diferencial de Foxa2 y como genes reporteros la proteína fluorescente verde (GFP) o el gen de resistencia a3puromicina (PAC). En estos experimentos de selectividad, solamente el vector lentiviral que incluye la secuencia promotora de 400pb resultó funcional, específico y sensible a la expresión endógena de Foxa2 para regular la expresión del gen reportero; demostrando ser una herramienta útil y flexible para la selección de células Foxa2pos.Como requisito indispensable para la validación y selección de neuronas Foxa2pos, primero confirmamos la expresión endógena de este factor de transcripción en progenitores mesencefálicos ventrales y neuronas dopaminérgicas derivadas de células pluripotentes murinas, recapitulando in vitro el desarrollo embrionario de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas. Luego verificamos la especificidad de este vector en dicho contexto neuronal, ratificando su versatilidad para seleccionar poblaciones Foxa2pos derivadas de cualquier fuente celular.En primer lugar empleamos los lentivirus para la selección de neuronas dopaminérgicas derivadas de células embrionarias murinas. En este contexto, utilizamos el vector FOXA2.PAC para seleccionar con puromicina progenitores neurales murinos que expresan Foxa2. Sin embargo, el uso de puromicina como paradigma de selección mostró un alto grado de toxicidad por lo cual el resto de los experimentos los realizamos con el vector FOXA2.GFP en combinación con separación celular por FACS (fluorescence-activated cell sorting).Durante la infección y selección por FACS, en algunos experimentos empleamos como control otro vector lentiviral que expresa de forma constitutiva la GFP (CMV.GFP). Con este vector, optimizamos la transducción y pudimos evaluar la capacidad de la fracción celular GFPpos seleccionada para integrarse y sobrevivir en el cerebro de ratas hemiparkinsonianas, previamente lesionadas con 6-hydroxidopamina. En4este experimento de trasplante celular, resultó evidente la necesidad de eliminar durante la selección las células indiferenciadas que permanecen proliferando en el cultivo. Para conseguirlo optimizamos un marcaje extracelular para SSEA1, una proteína de membrana de las células embrionarias murinas, que durante el proceso de FACS descartamos en las fracciones GFP. Dichas fracciones post-FACS mostraron un alto grado de pureza y se caracterizaron de forma inmediata por PCR cuantitativa e immunofluorescencia. La flexibilidad de este vector y su capacidad para enriquecer una población Foxa2posGFPpos derivada de células pluripotentes murinas nos motivó a investigar su utilidad para seleccionar progenitores dopaminérgicos derivados de células pluripotentes humanas, una fuente celular con aplicaciones más relevantes.Para la diferenciación dopaminérgica derivada de células embrionarias humanas, empleamos factores que favorecen de forma eficiente la inducción neural con una identidad regional típica del mesencéfalo ventral, donde se originan las neuronas dopaminérgicas (Perrier et al., 2004, Sanchez-Pernaute et al., 2008, Kriks et al., 2011). De forma similar a los progenitores neurales murinos, la transducción lentiviral de progenitores neurales humanos con el vector FOXA2.GFP se realizó alrededor de la cuarta semana in vitro (estadio de expansión).La especificidad de este vector en un contexto neuronal humano y su utilidad para seleccionar poblaciones Foxa2pos se comprobó en diferentes líneas pluripotentes que dan lugar a neuronas dopaminérgicas mesencefálicas en los estadios más avanzados de diferenciación. La caracterización de las fracciones GFP a partir de la selección por FACS se realizó de forma inmediata por PCR cuantitativa en la mayoría de los experimentos. En otros casos, pudimos caracterizar por5immunofluorescencia las fracciones GFP mantenidas in vitro a partir de co-cultivos con astrocitos estriatales irradiados, los cuales mejoran la viabilidad post-FACS (Hedlund et al., 2008).Como resultado de la selección por FACS, la fracción GFPpos de progenitores murinos y humanos transducidos con el vector FOXA2.GFP, mostró un enriquecimiento para marcadores mesencefálicos ventrales. Sin embargo, con esta estrategia no purificamos ninguna población neuronal sino que enriquecemos en una población Foxa2pos con un fenotipo de placa basal mesencefálica, con expresión de marcadores típicos de esta región que además de Foxa1/2, incluyen moléculas como netrina y F-espondina.Finalmente, empleamos un vector retroviral para sobre expresar Foxa2 en progenitores neurales humanos como una estrategia alternativa para validar nuestro paradigma de selección basado en la expresión endógena de Foxa2. En estos experimentos comprobamos que la selección de células humanas sobre-expresando Foxa2 genera una población enriquecida en marcadores mesencefálicos ventrales similar a la obtenida con el vector basado en la expresión endógena. Estos resultados descartan que la incapacidad del promotor Foxa2 (400pb) para enriquecer en neuronas dopaminérgicas durante la selección endógena sea debida a causa técnicas. Adicionalmente, el cultivo prolongado de células transducidas para sobre-expresar Foxa2 y mantenidas en condiciones de diferenciación terminal, también dio lugar a una población mayoritaria de progenitores mesencefálicos ventrales con características de radial-glia.De forma conjunta, nuestros resultados sugieren que el factor de transcripción Foxa2 no es suficiente para seleccionar neuronas dopaminérgicas derivadas de células pluripotentes. Sin embargo, este vector lentiviral es una herramienta útil para seleccionar poblaciones6Foxa2pos derivadas de cualquier fuente pluripotente, incluidas las IPSCs (induced pluripotent stem cells); enriqueciendo un fenotipo de placa basal que permitiría el estudio in vitro de importantes funciones biológicas del desarrollo como la ventralización tisular del tubo neural, el posicionamiento y diferenciación neuronal e incluso la generación de organoides neurales de forma más homogénea y estructurada.