Estudio de las modificaciones post-traduccionales de nrta, subunidad periplasmica del sistema de transporte de nitrato/nitrito en phormidium laminosum

Résumé

El análisis por electroforesis bidimensional (2-DE) de membranas plasmáticas de la cianobacteria Phormidium laminosum cultivada con nitrato revela, después de teñir los geles con plata, más de 150 spots correspondientes a polipéptidos diferentes. El posterior análisis por Western blot de estos geles, utilizando anticuerpos policlonales de conejo, revelan la presencia de 6-7 isoformas de NrtA, con la misma masa molecular (48 kDa aprox.) pero con una variación en su punto isoeléctrico de 0.10-0.15 unidades de pH. Al revelar por Western blot usando anticuerpos anti fosfo-tirosina, aparecen spots que coinciden en pI y masa molecular con los correspondientes a la proteína nativa, lo que indica que la proteína nativa está fosforilada. En este trabajo se estudia el efecto de dicha fosforilación en la regulación de la asimilación del nitrógeno utilizando una proteína mutante de sustitución de la tirosina fosforilable por una asparragina. Los resultados muestran que la fosforilación tiene una función estabilizadora dificultando la desestructuración tridimensional de la proteína. Además se ha conseguido purificar la proteína NrtA nativa a partir de membranas plasmáticas y se ha detectado en muestras de membranas la presencia de la proteína NrtD mediante espectrometría de masas. Este resultado contrasta con la localización de la otra subunidad de hidrólisis de ATP del transportador NRT (NrtC), lo que podría implicar que se NrtD sea una proteína de unión a membrana o que interaccione fuertemente con el componente transmembranal del transportador NrtB. En cualquiera de los casos, se demuestra un comportamiento diferente de NrtD y NrtC, lo que evidencia que su aportación al proceso de transporte podría ser distinto.