Xenobiotic exposure under hypoxic conditions in aquatic organismsInteractions between the signaling routes mediated by the HIF-alfa and AHR transcription factors

Resum

Las rutas moleculares encargadas del metabolismo de xenobióticos y de la adaptación a condiciones de escasez de oxígeno están mediadas respectivamente por el receptor de hidrocarburos arilo (AHR) y el factor 1¿ inducido por hipoxia (HIF-1¿). Ambos (AHR y HIF-1¿) necesitan heterodimerizar en el núcleo celular con el translocador nuclear del receptor de hidrocarburos arilo (ARNT) para provocar la respuesta transcripcional adecuada a sus respectivos estímulos desencadenantes. Esta coincidencia sugiere que la aparición simultánea de dichos estímulos podría causar la competencia entre AHR y HIF-1¿ por ARNT, limitando la capacidad de los organismos afectados para responder adecuadamente a esa situación. El objetivo principal de este trabajo es la contribución al estudio de posibles interacciones que involucran a los HIF-¿s, a AHR y a ARNT, miembros de la familia de factores de transcripción bHLH-PAS, en animales acuáticos. Para ello se diseñaron cuatro experimentos diferentes, en los que mubles Chelon labrosus, mejillones Mytilus galloprovincialis y hepatocitos de trucha Oncorhynchus mykiss recién aislados fueron estudiados bajo diferentes condiciones experimentales incluyendo diferentes concentraciones de oxígeno disuelto y exposición a compuestos químicos agonistas de AHR. En general, se midieron varios parámetros, pero el análisis se centró en la regulación transcripcional de genes previamente seleccionados. Estos incluían los factores de trancripción previamente mencionados y diversos genes involucrados en la respuesta adaptativa regulada por ellos. Sin embargo, en las bases de datos sólo existía información parcial sobre la secuencia nucleotídica de dichos genes de muble y mejillón, así que tuvieron que ser secuenciados. Los principales puntos de discusión de cada uno de los cuatro experimentos serán presentados a continuación.Con la intención de aumentar el conocimiento sobre la ruta molecular de adaptación a hipoxia en bivalvos, se planeó un experimento con mejillones M. galloprovincialis. Tras aclimatarlos, los mejillones se introdujeron en cuatro tanques diferentes en los que serían sometidos a tres tratamientos diferentes mientras que uno de los tanques serviría como control. Los mejillones fueron mantenidos en condiciones de hipoxia (2.5 mg O2/L), bajo exposición a benzo[a]pireno B[a]P (0.4 mg/L) y bajo exposición a B[a]P en condiciones de hipoxia durante 1, 7 y 14 días. Se seleccionaron varios genes involucrados (al menos en vertebrados) en la ruta molecular de adaptación a hipoxia para cuantificar sus niveles de transcripción en la glándula digestiva de mejillones: el factor de transcripción hif-¿ y los genes citocromo c oxidasa subunidad VI (cox-4), hexoquinasa (hk), fructosa-bisfosfato aldolasa (aldolasa) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (pepck) relacionados con el suministro energético y regulados por los HIF-¿s en vertebrados. Para empezar se llevó a cabo una secuenciación parcial de sus secuencias de mRNA, lo que permitió realizar análisis de PCR cuantitativa (qPCR) sobre todos los genes excepto aldolasa. Además de ello, se caracterizó el patrón transcripcional de hif-¿ en los tejidos de mejillones no tratados. Se encontraron tránscritos de este gen en todos los tejidos analizados (branquias, músculo, glándula digestiva, y manto) pero especialmente en branquias, tal y como se ha observado en estudios previos en otros moluscos. Los niveles transcripcionales de hif-¿ tuvieron una tendencia decreciente en la glándula digestiva de los mejillones sometidos a hipoxia. Se propuso que esto se debió a una retroalimentación negativa desencadenada para proteger al animal de la reoxigenación que cabría esperar en la zona intermareal, lugar de residencia de esta especie de mejillón. En general, hk y pepck (relacionados con el metabolismo de glucosa) mantuvieron inalterados sus niveles transcripcionales. Esto podría estar reflejando un esfuerzo por parte de los mejillones para mantener su actividad glicolítica mientras reprimen su metabolismo general para combatir la escasez de oxígeno. Estas tendencias fueron modificadas tras exponer los mejillones a B[a]P bajo condiciones de hipoxia, pero de manera no significativa.En base al anterior estudio se llevó a cabo un experimento de laboratorio in vivo empleando esta vez mubles Chelon labrosus, una especie centinela de contaminación que habita áreas altamente eutrofizadas y es empleada en programas de monitorización en la costa Vasca. Se siguieron las pautas del anterior estudio realizado en mejillones, introduciendo peces juveniles en cuatro tanques diferentes. Los animales fueron mantenidos en condiciones de hipoxia (2.5 mg O2/L), bajo exposición a benzo[a]pireno B[a]P (0.4 mg/L) y bajo exposición a B[a]P en condiciones de hipoxia durante 1, 7 y 14 días. Durante el experimento los mubles fueron observados para detectar potenciales cambios en su comportamiento debidos al efecto de los diferentes tratamientos. Cada uno de los tres días de muestreo se cuantificaron los niveles transcripcionales de los factores de transcripción hif-1¿, hif-2¿ hif-3¿ y arnt y de los genes factor de crecimiento endotelial vascular (vegf), aldolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapdh), pepck (involucrados en la ruta de adaptación a hipoxia) y citocromo p450 1a1 (cyp1a1-involucrado en la ruta de detoxificación de xenobióticos) en hígado y branquias. Al final del experimento se realizó una evaluación histopatológica de las branquias, un órgano especialmente afectado por las condiciones de hipoxia. De la evaluación del comportamiento de los animales se dedujo que aquellos sometidos a condiciones de escasez de oxígeno disuelto (en presencia o ausencia de B[a]P) desplegaron una estrategia energética ahorrativa, dado que su actividad se redujo de manera conspicua. La exposición a B[a]P bajo condiciones de hipoxia causó la reducción de los niveles transcripcionales de los tres parálogos de hif-¿ en hígado y de arnt en hígado y branquias; dicha tendencia podría condicionar la capacidad adaptativa de los animales al afrontar simultáneamente ambos estresores. Puede observarse un patrón transcripcional común entre los diferentes factores de transcripción estudiados, lo que sugiere la presencia de un mecanismo común que regula sus niveles de transcripción. La escasez de oxígeno disuelto no alteró por sí sola los niveles de transcripción de las enzimas glicolíticas estudiadas, ni en hígado ni en branquias. Esto podría ser reflejo de un esfuerzo por parte de los animales para mantener dichos niveles de transcripción incluso en un escenario de represión general de los niveles de metabolismo. Dado que la coexposición a B[a]P bajo condiciones de hipoxia tendió a subregular los niveles transcripcionales de aldolasa y a sobrerregular los de pepck en ambos tejidos, la combinación de ambos tipos de de estrés podría estar causando un desequilibrio en la glicólisis de estos animales. El hecho de que la sobrerregulación de cyp1a1 causada por B[a]P fuese acentuada al añadir condiciones de hipoxia refuerza la hipótesis de la presencia de interacciones entre los procesos de regulación de ambas rutas de adaptación. Aparentemente, y de manera inesperada, el metabolismo de xenobióticos se vio incrementado bajo condiciones de hipoxia, mientras que se tendió a atenuar la respuesta adaptativa a la escasez de oxígeno, sugiriendo que la interacción propuesta entre ambas rutas adaptativas transciende la competición por ARNT. En concordancia, el incremento de la afectación por aneurismas en branquias de los peces sometidos a hipoxia (considerado un efecto secundario de la adaptación a la escasez de oxigeno) fue atenuado tras coexponer los animales a B[a]P, impulsando la idea de que la adaptación a hipoxia pudo ser obstruida por la exposición a agonistas de AHR.La experiencia obtenida en los anteriores experimentos in vivo de laboratorio fue aplicada en la consecución de un nuevo experimento de campo. Cómo área de estudio se seleccionó el puerto de Pasaia, en la desembocadura del rio Oiartzun (costa del País Vasco). Dicho puerto es conocido por estar crónicamente contaminado; además, en él se han descrito fenómenos periódicos de escasez de oxígeno. Allí se introdujeron en dos bateas diseñadas ad hoc mubles juveniles de la especie C. labrosus durante 5 y 21 días. Una de las bateas fue colocada en la parte interna del puerto (IH) y la otra en la parte externa (OH). En ambos días de muestreo se cuantificaron los niveles transcripcionales de los factores de transcripción hif-1¿, hif-2¿ hif-3¿ y arnt y de los genes gapdh (involucrado en la ruta de adaptación a hipoxia) y cyp1a1 (involucrado en la ruta de detoxificación de xenobióticos) en hígado y branquias. Tras 7, 14 y 21 días de experimento se detectaron niveles relativamente bajos de oxígeno disuelto en IH, mientras OH presentó condiciones normóxicas. Junto a los peces se alojaron mejillones, en cuyos tejidos blandos se midió la biodisponibilidad de diversos compuestos químicos tras 21 días de experimento. Así, se detectaron mayores cantidades de contaminantes en IH que en OH, aunque ambos lugares tenían cantidades muy similares de PAHs y PCBs en combinación. Los niveles de transcripción de hif-1¿ aumentaron en el hígado y las branquias (especialmente) de los mubles expuestos a contaminantes químicos en condiciones de escasez de oxígeno en IH durante 5 días. Tras 21 días en IH, los niveles transcripcionales de hif-3¿ se vieron reducidos en ambos tejidos analizados. Sorprendentemente, las branquias de los peces alojados en IH mostraron niveles transcripcionales de hif-3¿ menores que aquellos observados en las branquias de los peces de OH durante todo el experimento. Por otra parte, los niveles transcripcionales de arnt aumentaron en ambos tejidos en los peces alojados en IH durante 5 días. Esto podría enfocarse como una estrategia para evitar que ARNT pasase a ser un factor limitante en una situación de exposición a xenobióticos bajo condiciones de escasez de oxígeno. En general, se observa que hif-1¿, hif-3¿ y arnt comparten un patrón transcripcional similar, sugiriendo la presencia de un mecanismo de regulación común para los tres factores de transcripción. Se observó la sobrerregulación de gapdh en hígado y branquias de los mubles alojados en IH durante 5 y 21 días respectivamente, indicando un probable aumento de la glicólisis. Para finalizar, en ambos puntos de estudio (IH y OH) se encontraron similares niveles de transcripción de cyp1a1, lo que sugiere que la escasez de oxígeno en IH no alteró la ruta molecular de detoxificación de xenobióticos y que ARNT no fue un factor limitante para la transcactivación de AHR.En el último experimento, se emplearon cultivos primarios para estudiar la interacción entre las rutas moleculares de adaptación a hipoxia y detoxificación de xenobióticos en hepatocitos de trucha O. mykiss recién aislados. Fue ideado como una aproximación en línea con el ¿principio de las tres Rs¿, permitiendo realizar ensayos in vitro con un mayor rendimiento que aquellos realizados previamente in vivo. Nada más aislar los hepatocitos, éstos fueron cultivados bajo tres atmósferas de oxígeno diferentes: hiperóxica (7±0.5 mg O2/L), normóxica (1.75±0.25 mg O2/L) e hipóxica (0.55±0.25 mg O2/L). La primera se corresponde con las atmósferas normalmente empleadas en los cultivos de hepatocitos de trucha, la segunda busca asemejarse a las condiciones presentes en un hígado normóxico in vivo, y la última busca imitar las condiciones presentes en hígado en hipoxia. Para generar 6 grupos experimentales diferentes, se añadió B[a]P (128 nM) a la mitad de las células mantenidas en cada una de las tres atmósferas antes descritas. Primero se midió la viabilidad celular en términos de actividad metabólica y estabilidad de membrana. También se midieron los niveles de producción de lactato como un indicador del uso del metabolismo anaerobio por parte de los hepatocitos. Por último, se cuantificaron los niveles de transcripción de hif-1¿ and ahr2ß y los genes gapdh and cyp1a1 regulados por ellos. El hecho de que el grupo experimental hiperoxia-B[a]P produjese resultados altamente variables en términos de estabilidad de membrana, incluyendo pérdidas considerables de viabilidad celular, cuestiona la idoneidad del uso de dichas condiciones de oxígeno a la hora de evaluar los efectos de compuestos químicos en cultivos de hepatocitos de pez. Las mediciones de acumulación de lactato indicaron que la cantidad de este metabolito aumentó según la concentración de oxígeno se reducía, esto indicaría que las células estaban aumentando su dependencia en el metabolismo anaerobio. Sin embargo, la exposición a B[a]P bajo condiciones de normoxia e hipoxia durante 72 h redujo la acumulación de lactato, quizá como consecuencia de una aumento de la actividad de la ruta de la pentosa fosfato entendida como un mecanismo para asistir la biotransformación de B[a]P. El tráfico de moléculas (tales como el lactato) existente entre el hígado y el resto de órganos in vivo no ocurre in vitro, esto podría generar respuestas inesperadas en ciertas situaciones complejas como la exposición a B[a]P. Tras someter los hepatocitos a condiciones de hipoxia durante 72 h sus niveles transcripcionales de hif-1¿ se vieron reducidos, probablemente en respuesta a un proceso de retroalimentación negativa. Por otra parte, se detectó una ligera sobrerregulación de gapdh en el grupo normoxia-B[a]P, quizá para alimentar los procesos de detoxificación de xenobióticos produciendo energía extra. Dicha tendencia no fue bloqueada en el grupo hipoxia-B[a]P, lo que sugiere la ausencia de competición por ARNT. Los niveles transcripcionales de ahr2ß tendieron a estar sobrerregulados bajo exposición a B[a]P. Esta tendencia fue bloqueada bajo condiciones de hipoxia, sugiriendo la presencia de un mecanismo de regulación anterior que aparentemente favorece la respuesta ante hipoxia en estas condiciones. No obstante, la sobrerregulación transcripcional de cyp1a1 durante la exposición a B[a]P se mantuvo al combinar dicha exposición con condiciones de hipoxia, de hecho la escasez de oxígeno sobrerreguló dicho gen por sí sola. Esto refuerza la idea de la ausencia de competición por ARNT entre los HIF-¿s y AHR bajo esas condiciones. Cabe destacar que los patrones de transcripción mostrados por hif-1¿ y ahr2ß resultaron ser muy similares, especialmente bajo hiperoxia. Estos resultados nos permiten sugerir la presencia de un mecanismo de regulación previo compartido por ambos factores de transcripción.Para finalizar concluimos que la exposición de peces a xenobióticos bajo condiciones de hipoxia altera el control de la transcripción de los genes involucrados en las rutas moleculares de adaptación a hipoxia y detoxificación de xenobióticos por vías diferentes de la competición por ARNT, probablemente involucrando un mecanismo de regulación de la transcripción aparentemente compartido por los genes hif-¿s, ahr y arnt. En el caso de mejillones se requieren más estudios para clarificar la presencia y la naturaleza de dichas interferencias.