Molecular toxicity of nanomaterials

Zusammenfassung

En los últimos 20 años un nuevo tipo de materiales, los nanomaterials, han aparecido en la vida cotidiana y atrajo amplia atención debido a sus propiedades peculiares. Nanomateriales, emitidas a partir del desarrollo de la nanociencia, tienen propiedades particulares procedentes de sus dimensiones nanométricas. Ellos representan un nuevo paso en la ingeniería de los procesos de reducción del tamaño de los productos y traen nuevas capacidades y conocimiento a materiales de uso cotidiano. Las inusuales propiedades ópticas, mecánicas y magnéticas de los nanomateriales permiten su uso potencial para la optimización de dispositivos biomédicos. Nanomateriales como graphene podría ser utilizado en la detección microbiana y dispositivos de diagnóstico. Después de haber cambiado cínicamente la superficie del graphene uno puede utilizarlo para desarrollar detectores microbianos o diagnósticos médicos. Además, las hojas de óxido de graphene se sabe que son altamente tóxicas para las bacterias y se podría utilizar dentro de superficies bactericidas para productos de higiene y envases de alimentos. Del mismo modo otro nanomaterial, las nanopartículas de semiconductor, llamados puntos cuánticos (QD), se ha demostrado que absorben la luz UV y que emiten luz fluorescente con una longitud de onda mediana dependiente de sus tamaños. Acoplamiento de la propiedad ópticas atípicas de QD y de la posibilidad de unirles covalentemente con moléculas de seguimiento específico en su superficie se puede utilizar como marcador para seguir una sola molécula adentro de una célula in vivo o ex vivo. QD son más brillantes y más estables que los convencionales tintes fluorescentes, por lo tanto, han demostrado una amplia aplicabilidad a la imaginería medícale como colorantes fluorescentes específicos. Además, acoplado a una molécula diana, pueden ser utilizados para lograr imágenes de células con alta sensibilidad. Su tamaño extremadamente pequeño permite la adquisición de muchas imágenes de planes focales y la reconstrucción de imágenes en 3D que representan la distribución de las moléculas de interés adentro de las células in vivo o ex vivo. Gracias a la alta resolución y la capacidad de seguimiento en tiempo real de la fluorescencia de los QD, el movimiento de una molécula de interés puede ser seguido durante largos períodos de tiempo. También esto sea posible gracias a la capacidad de unir anticuerpos, estreptavidina, péptidos, aptámeros, o ligandos de pequeño tamaño en la superficie QD de una manera altamente controlada. Debido su pequeño tamaño, su alta capacidad de dispersión, y la ausencia de drenaje linfático en los tumores, los QD pueden usarse para suministrar moléculas de silenciación de genes en células cancerosas. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los nanomateriales presentan posibles riesgos para la salud humana. Estos riesgos para la salud son, fundamentalmente, dependientes de los materiales utilizados en su preparación, pero también el tamaño extremadamente pequeño de los nanomateriales y sus gran superficies resulten en una alta capacidad para ser inhalado, ingerido, o de adsorberse atreves de la piel. Los nanomateriales incorporados dentro de materiales compuestos en dispositivos biomédicos implantados directamente podría liberarlos en el tejido vivo y sus alta penetración y distribución en los organismos vivos generan otro peligro potencial. Por ejemplo, fue demostrado que las nanopartículas son capaces de trasladarse lejos de su lugar de entrada a través de la sangre y de depositarse en sitios distantes como el riñón quien parece ser incapaz de eliminarlos. Se ha demostrado recientemente que algunos nanomateriales inducían toxicidad en las células in vitro. Esta toxicidad parece originar de la gran superficie en relación con el volumen de las nanopartículas, eso hace que las nanopartículas pueden ser muy reactivas, y en algunas situaciones catalíticas. En el interior de los medios acuosos, algunos QD han demostrado que pueden liberar iones de metales pesados que son tóxicos por fotólisis o hidrólisis cuando su revestimiento de polímero está dañado o imperfecto. Por ejemplo, algunos estudios han demostrado que las nanopartículas de CdSe no son estables en medios biológicos. Estas nanopartículas liberan iones tóxicos de cadmio en el medio circundante debido a su fotólisis o hidrólisis. La presencia de una baja cantidad de iones de cadmio puede ser altamente tóxica para las células en cultura. También, debido a la alta reactividad de la superficie de los nanomateriales, estos pueden catalizar la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) a partir de las moléculas ambientes. La presencia de ROS puede conducir a la muerte de las células por necrosis a través de la ruptura de la membrana celular debido a la peroxidación de los lípidos que la constituyen. También la presencia de ROS puede conducir a la muerte de las células por apoptosis, a través de los daños generados por ROS sobre las proteínas, lípidos, y el ADN de las células. La generación de iones tóxicos y de radicales libres tóxicos en la superficie del nanomaterial crea dos toxicidades celulares: una directa y otra indirecta. Los mecanismos de toxicidad conectados con estas dos toxicidades han sido ampliamente estudiados y son bien conocidos actualmente. Recientemente, un otro nivel de toxicidad fue descubierto; este nivel puede ser calificado de toxicidad molecular de los nanomateriales. Diversos nanomateriales, como las nanopartículas de óxido de hierro, las nanopartículas de óxido de zinc, las nanopartículas de dióxido de titanio, los nanotubos de carbono, y las nanopartículas de óxido de cobre, fueron mostrado capaz de inducir daños sobre el ADN cuando interactúen físicamente. El proceso por lo cual el daño ocurre no está claro al momento, pero podría originarse de la valencia de la superficie de estos nanomateriales y intervenir a través de un fenómeno de oxidación de la molécula de ADN. Sin embargo, fue demostrado que la presencia de nanomateriales en los fluidos biológicos podría crear inestabilidad en la estructura de las biomoléculas. La capacidad de los nanomateriales de adsorber a biomoléculas sobre su superficie, debido a su gran área superficial, fue demostrada claramente. Pero un análisis reciente de las capas de biomoléculas, recubriendo la superficie de las nanopartículas de oro, han mostrado que estas presentan una estructura tridimensional ligeramente modificada por comparación a las biomoléculas dispersas. Este efecto ha sido cuestionada y cuando solo algunos estudios han demostrado tales efectos de los nanomateriales sobre las biomoléculas, otros no han mostrado ningún efectos de los nanomateriales en las mismas biomoléculas. Este efecto modificador de los nanomateriales sobre las biomoléculas podría ser muy preocupante para ciertas proteínas, cual replegamiento puede conducir a la aparición de elementos tóxicos en el organismo. Estas proteínas son llamadas material amiloide y son péptidos y proteínas que nativamente o bajo ciertas condiciones pueden someterse a un replegamiento de su estructura interna que conduce a una mejorada tendencia a la agregación. Esta agregación, también llamado fibrillisation amiloide, presenta un alto grado de organización y genera agregados y fibras micrométricas que son tóxicos para las células. Desafortunadamente, recientes artículos científicos han demostrado que algunas nanopartículas parecen ser capaces de mejorar la fibrillisation amiloide de péptido amiloide como el péptido A¿ (1-42). En cuanto a proteína estable este efecto no fue todavía demostrado para todos los tipos de nanopartículas. Y la razón esta diferencia de efecto no es conocida actualmente. Los pequeños agregados solubles de A¿ son conocidos por ser extremadamente tóxicos para las células. Fueron demostrados como capaces de generar ROS en el medio circundante y capaz de oxidar directamente los lípidos de la membrana celular. Esta oxidación y la presencia de óxido de reactivo pueden explicar la muerte de las células: directamente por necrosis a través de una brecha en la membrana o indirectamente por apoptosis inducida por los oxidantes. Los materiales amiloide están implicados en un gran número de enfermedades degenerativas, también llamada proteopathies, para la cual no hay curas conocidas. Entre esos proteopathies uno puede encontrar la enfermedad de Alzheimer (AD) o la enfermedad de Parkinson, estas dos enfermedades cuya incidencia se prevé que aumentará drásticamente en las próximas décadas. La posibilidad de que la presencia de nanomateriales en el medio ambiente juega un papel en la incidencia de estas proteopathies tiene que ser investigada. Una de las formas para clarificar un enlace potencial es analizar el efecto de los nanomateriales sobre péptidos y proteínas implicados en estas enfermedades in vitro. En este estudio hemos demostrado que el efecto de los nanomateriales en la estabilidad de estructura de proteínas se debe a la carga presente en la superficie de los nanomateriales. En efecto, nuestra hipótesis de trabajo era que la fuerza principal que causa el comportamiento pro-amyloidosis sea la carga presentado en la superficie de las nanopartículas. Con el fin de probar esto, hemos desarrollado nanopartículas de mismas composición química, forma, estructura superficial, y tendencia de agregación, sino que presenta un valor diferente de carga en su superficie. Estas nanopartículas fueron incubadas con diferentes biomoléculas: el A¿ que es un péptido amiloide fuertemente inestable, la insulina, una proteína que es inestable sólo bajo condiciones muy desestabilizadores, y albúmina de suero bovino (BSA), una proteína grande conocido por su estabilidad bajo condiciones de desestabilización. Al analizar al mismo tiempo la estructura de estas biomoléculas, la distribución de tamaño en diferentes mezclas, y la presencia de estructura intermolecular especificas de amiloide, hemos sido capaces de comprender la acción de la carga de las nanopartículas sobre la agregación de los péptidos y proteínas. Dentro de esta tesis hemos demostrado que diferentes proteínas reaccionan de manera diferentes a la misma carga en la superficie de un nanomateriale definido. Curiosamente, hemos demostrado que la presencia de cargas positivas en el superficie de los QD inhibe la formación de agregados amiloideos de A¿ y favorece la formación de una tapa de péptidos no estructurados en esta superficie. También la presencia de cargas positivas en la superficie de los QD indujo una agregación débil de insulina o BSA en esta superficie pero no indujo el replegamiento amiloide de estas proteínas. Por oposición, la presencia de carga negativa en la superficie de los QD parece mejorar la fibrillisation amiloide de A¿ y de insulina. También, las cargas negativas inducen la agregación de BSA en la superficie de los QD, pero parecen tener ningún efecto sobre la estructura interna de BSA. Este efecto de aumento por las cargas negativas parece ser dependiente de la estabilidad interna de las biomoléculas. Sorprendentemente, los QD que llevan cargas negativas débiles parecen inducir o mejorar a la agregación amiloide de proteínas relativamente estables, como la insulina, mientras que los péptidos inestables, como A¿¿ parecen más influenciado por las cargas fuertemente negativas. Al modificar el radio de los QD, demostrábamos que el efecto de los nanomateriales sobre la estructura de la proteína es dependiente no sólo de la carga presente en su superficie pero adicionalmente de la distribución de estas cargas en la superficie. Hecho proteína de insulina parece agregándose a cualquier QD que lleva cargas negativas débiles pero sólo los QD que tienen un tamaño de núcleo de 3,3 nm parecen ser capaz de inducir el replegamiento de la proteína y de iniciar la formación de agregados amiloideos. Nuestra hipótesis para explicar este efecto es que las proteínas en suspensión no reaccionan a una carga específica presentada en la superficie de los QD sino a una distribución especifica de carga tridimensional. Sobre la base de estos datos, hemos sido capaces de desarrollar un nuevo tipo de agente terapéutico basado sobre una distribución de carga controlada en la superficie de unos nanomateriales que permiten una interacción específica de esos nanomateriales y de proteínas especificas sin necesitar el uso de moléculas de reconocimiento. Anteriormente, se había demostrado que mediante una selección apropiada de los grupos químicos en la superficie de los QD se podría crear QD con un efecto de agregación no amiloide de péptidos inestables. Por lo tanto, se podría crear QD con la capacidad de agregar unos péptidos amiloideos tóxicos específicos, como A¿, con el fin de reducir su efecto tóxico en el organismo mediante sus eliminaciones por el sistema inmunitario. Dado que se había demostrado antes que la presencia de cargas positivas en la superficie de los QD induce una agregación no amiloide de A¿, hemos desarrollado un QD estable en medios orgánicos, capaces de interactuar fuertemente con un A¿ péptido, y con una capacidad limitada de endocitosis en las células vivas. En esta tesis hemos demostrado que nuestro producto estaba cumpliendo con estos tres objetivos, pero que tenía un potencial uso terapéutico limitado debido a su efecto sobre una otra proteína de prueba, la insulina. Nuestra hipótesis es que estos efectos secundarios se deben a la presencia de carga negativa débil, en la superficie de los QD, utilizado para estabilizarlos en tampón fisiológico y que fueon demostrado antes como capaces de inducir el replegamiento de la insulina amiloide. Sin embargo, este trabajo demuestra la viabilidad de tal sistema y uno se puede imaginar que un sistema similar, usando otros grupos químicos para estabilizar los QD o cambiando el esquema de las cargas débiles, podría alivió la disposición de estos péptidos A¿ del organismo por los macrófagos y/o microglia. Además, mediante la sustitución de los QD por nanopartículas superparamagnéticas se podría prever para eliminar específicamente estos péptidos de organismos vivos. El descubrimiento del efecto de repartición de las cargas en la superficie de los objetos de tamaño manométrico en las biomoléculas alrededores abre el camino a una mejor comprensión de la toxicidad de los nanomateriales y al desarrollo de nuevos nanomateriales con una estabilidad in vivo mejorada para aplicaciones biomédicas (por ejemplo, suministro de fármacos, implantes biomédicos, y agentes de marcado). El desarrollo de recubrimientos nanoestructurados con tecnologías de control de la distribución de cargas podría mejorar el desarrollo de implantes bio-compatibles, y otros sistemas biónicos, reduciendo la necesidad de tratamiento con drogas inmunosupresoras. En efecto, si la superficie de los implantes se recubrió con una distribución controlada de cargas a la escala del nanómetro que proporcionaría propiedades de immuno-furtiva y de prevención de la formación de agregados de proteína al contacto entre el implante y la materia orgánica. Por lo tanto, aumentara la vida útil de tales sistemas y prevendrá complicaciones para los pacientes, como la formación de trombos en la sangre.