Utilización de la perturbación génica homocigota al azar para identificar genes implicados en la retención microvascular y adhesión endotelial hepática del cáncer de colon humano ht-29

Résumé

El presente proyecto pretende contribuir al conocimiento sobre las implicaciones patogénicas y fisiopatológicas específicas del transcriptoma del cáncer de colon, para encontrar moléculas reguladoras del proceso de metástasis hepática, con posible aplicación en el diagnóstico y la terapéutica. Combinando la tecnología para la perturbación génica homocigota al azar del genoma de células eucariotas, con la detección e identificación individualizada de genes perturbados a través de bioensayos in vitro sobre mecanismos de metástasis, el presente proyecto pretendió identificar cuantos genes estén implicados en la regulación de la adhesión de las células del cáncer de colon a la pared microvascular hepática. Tras la perturbación génica homocigota al azar mediante transfección de los vectores pNEBR-X1 y GSV, se creó una biblioteca celular del cáncer de colon humano HT-29 con su genoma modificado, y cuyo porcentaje de adhesión al endotelio del sinusoide hepático de ratón en cultivo primario disminuyó desde un 30% hasta un 7%, demostrando así una alteración en la mayor parte de los genes que expresan moléculas necesarias para la adhesión del HT-29 al endotelio hepático. El aislamiento, mediante activación e inactivación sucesivas del vector inducible GSV, de la fracción celular del HT-29 que sufre alteraciones en la expresión de los genes implicados en la adhesión del tumor al endotelio microvascular hepático, seguido de clonación dilucional de esta fracción celular, permitió obtener 160 sublíneas clonogénicas viables del HT-29 con alteración de genes individuales implicados en su adhesión al endotelio hepático. Nueve sublíneas tuvieron alteración verificable por PCR cuantitativa frente al control sin el vector GSV, de los siguientes genes codificantes de proteína: PVR, DGCR8, EFEMP1, USP11, PPP6R2, KIAA0753, DPY19L1, DGKE y ITPKC. Cuatro de las nueve sublíneas de HT-29 presentaron alteración en la expresión de genes previamente relacionados con el cáncer. Estos genes fueron DGCR8, EFEMP1, PVR y USP11. Más aún, los genes PVR y EFEMP1 ya habían sido relacionados con el mecanismo de la adhesión celular; el gen DGCR8, con la biogénesis nuclear de los microRNAs; los genes DGKE, PPP6R2, ITPKC y USP11, con vías de señalización; y los genes DPY19L1 y KIAA0753 fueron de función desconocida. La citometría de flujo demostró que los porcentajes de células HT-29 en cultivo con expresión de las proteínas expresadas por los genes EFEMP1, PVR y DGCR8 fueron del 22,23%, 5,29% y 10,32% respectivamente. Sin embargo, el silenciamiento de dichos genes en células HT-29, que inhibió alrededor del 90% la expresión de sus proteínas verificadas por Wester Blot, demostró una inhibición significativa del 50% en la adhesión in vitro del HT-29 al endotelio sinusoidal hepático, y del 80% en la retención microvascular hepática in vivo. Estos resultados demuestran que la fracción celular del HT-29 con capacidad de retención microvascular en hígado y de adhesión a su endotelio sinusoidal es muy pequeña, siendo los genes identificados relevantes para su regulación. Por tanto, el método de perturbación génica homocigota al azar en combinación con los ensayos de selección celular por adhesión al endotelio sinusoidal hepático constituyeron una estrategia metodológica valiosa para el descubrimiento de nuevos genes del cáncer de colon implicados en la metástasis hepática.