Fusión de membranas modelo inducida por fosfolipasas y por fluctuaciones térmicas

Resumo

El objetivo principal de este trabajo, ha sido profundizar en el conocimiento del mecanismo de fusión de membranas. Para ello se estudió la fusión de vesículas inducida por fluctuaciones térmicas y por otro lado, la fusión inducida por la fosfolipasa C/esfingomielinasa de Pseudomonas aeruginosa. La fusión de membranas es un paso esencial en muchos procesos biológicos que se han estudiado en numerosos trabajos, pero aún no se conoce el mecanismo a nivel molecular. Como paso previo, se estudió la incorporación del colesterol en bicapas lipídicas, en forma de vesículas unilamelares. Para ello se cuantificó la cantidad de colesterol en bicapas formadas por fosfolípido:colesterol (con 33-75 mol% de colesterol) y se comparó con la mezcla original antes de hidratar el lípido. En la mayoría de los casos la proporción de colesterol presente fue menor que la esperada por lo que queda de manifiesto que un análisis cuantitativo de las vesículas es un requisito previo a la realización de cualquier experimento. La fusión de vesículas se indujo mediante el calentamiento gradual de la suspensión de vesículas entre 20-90ºC. Una relación equimolar es necesaria para ver agregación en la mezcla DOPC:Chol, la cual ocurría a 50ºC. La mezcla binaria no produce fusión de vesículas en el rango de temperatura estudiado, aunque la adición de 3 mol% de DAG induce fusión de membranas, observada mediante mezcla total de lípidos y mezcla de lípidos de la monocapa interna. La resonancia magnética nuclear de fósforo 31 (31P-RMN), la difracción de rayos X y la criomicroscopía electrónica (crio-TEM) de la mezcla con DAG, pero no en su ausencia, demostraron la existencia de una fase hexagonal invertida y también de una fase cúbica. Se ha sugerido que los intermediarios de fusión de membranas (stalk) poseen estructuras parecidas a las fases invertidas de los lípidos. Se utilizaron la microscopía confocal de fluorescencia y la calorimetría diferencial de barrido para estudiar el comportamiento de la mezcla compuesta por PC:PE:SM:Chol en una relación equimolar, en presencia y ausencia de ceramida. En ausencia de ceramida, se observó en vesículas unilamerales gigantes la presencia de una fase líquida-ordenada y una fase líquida-desordenada, mientras que al añadir ceramida se observó una tercera fase de tipo gel. Los propiedades de este dominio tipo gel se parecen a la mezcla binaria SM:ceramida, sugiriendo el desplazamiento del Chol por la Cer en las regiones líquidas-ordenadas ricas en SM:Chol. Así pues, tres tipos de dominios pueden coexistir en una vesícula en presencia de Cer: gel, líquido-ordenado y líquido-desordenado. Por otro lado, cuando se añade 10 mol% de diacilglicerol en vez de ceramida, las vesículas formadas poseen los lípidos distibuídos homogéneamente en una fase líquida-desordenada. La unión y la actividad de la fosfolipasa C/esfingomielinasa de Pseudomonas aeruginosa se monitorizó utilizando microscopía confocal fluorescente en vesículas unilamelares gigantes. Se marcaron con sondas fluorescentes específicas tanto la membrana como el enzima. Se utilizaron GUV compuestos de fosfatidilcolina, esfingomielina, fosfatidiletanolamina y colesterol en una relación equimolar, a los cuales se le añadió 5-10 mol% de ceramida y/o DAG que son los productos finales del enzima. Estudios morfológicos de los GUV en presencia del enzima indicaron que, aunque el enzima difunde rápidamente por el campo de observación, la unión del enzima parece ser lenta y al azar, ya que nuevas vesículas con enzima unido aparecen pasados varios minutos. Una vez detectadas las primeras uniones del enzima, les sigue una rápida unión masiva y una actividad catalítica más alta. El enzima se une preferentemente a zonas más fluidas (o más desordenadas) y en la mayoría de los casos, la actividad catalítica produce una fluidificación (más desorden) de las vesículas. Simultáneamente, vesículas que contienen dos dominios lipídicos separados y con forma de cacahuete (forma de 8) se convierten en esféricas. En una etapa posterior a la hidrólisis de los lípidos se forman agregados lipídicos, seguramente no-lamelares, enriquecidos en enzima y finalmente la vesicular se desintegra. Este último proceso ocurre más rápidamente en el caso de vesículas que contienen desde un principio dominios rígidos de ceramida. Por último, se estudió la fosfolipasa C/esfingomielinasa PlcHR2 de Pseudomonas aeruginosa en vesículas que contenían fosfatidilcolina, esfingomielina, fosfatidiletanolamina y colesterol en una relación equimolar. La actividad enzimática modifica las propiedades químicas produciendo ceramida y diacilglicerol. Se realizaron estudios bioquímicos de la actividad enzimática, y biofísicos de la agregación y la fusión de membranas inducidas por el enzima. Los productos finales del enzima, la ceramida y el diacilglicerol, tienen un efecto opuesto en las propiedades físicas de la membrana; el diacilglicerol inhibe la segregación de fases, mientras que la ceramida induce la formación de una nueva fase, la fase gel. Además, tienen distinto efecto sobre el enzima: el diacilglicerol aumenta la agregación y la fusión inducida por el enzima, mientras que la ceramida inhibe la actividad hidrolítica. La incorporación en las vesículas de los dos productos finales causa un aumento en la unión del enzima y una disminución de los tiempos de latencia en la hidrólisis. Se ha encontrado una buena correlación entre la estructura de la bicapa, unión del enzima a vesículas individuales y a poblaciones de vesículas, y la agregación de vesículas inducida por el enzima.