Characterization of the hiv-1 membrane and its interactions with anti-viral compounds using advanced microscopy techniques

Zusammenfassung

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus perteneciente al género Lentivirus que infecta principalmente linfocitos T CD4+. El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es un espectro de enfermedades causado por la infección por VIH, que interfiere con el correcto funcionamiento del sistema inmune y aumenta el riesgo de infecciones oportunistas que acaban causando la muerte del paciente. En 2016, alrededor de 36.7 millones de personas vivían infectadas por el VIH tipo 1 (VIH-1) y se produjeron cerca de 1 millón de muertes relacionadas con el SIDA.El VIH está recubierto de una bicapa lipídica adquirida de las células huésped durante la gemación. La proteína de envuelta (Env) es la única de origen viral que se expone en esta membrana. Env es responsable del reconocimiento del receptor CD4 y los correceptores CCR5 o CXCR4 en la membrana plasmática de la célula objetivo mediante la subunidad gp120 y la subsecuente fusión de las membranas celular y viral, mediada por la subunidad transmembrana gp41. Este proceso da lugar al poro de fusión por el que la cápside del virus se libera al citosol de la célula huésped. A pesar de que la envuelta lipídica es adquirida de la membrana plasmática de la célula infectada, la composición química de ambas es muy diferente, la membrana del virus se encuentra enriquecida en lípidos como el colesterol (hasta un 50% del contenido lipídico total). Por ello se ha propuesto que el virus adquiera su membrana de balsas lipídicas o lipid rafts en la membrana celular. Los rafts son nanodominios temporales enriquecidos en colesterol, esfingolípidos y ciertas proteínas a los que se les adjudica diferentes funciones gracias a la compartimentalización de elementos de la membrana plasmática. Se desconoce la razón por la que la gemación del VIH ocurre a través de estos dominios, sin embargo diferentes estudios han demostrado que la composición de la membrana viral es crítica para la infección, es decir, que la membrana juega un papel activo durante la fusión.En esta tesis se han estudiado diferentes características y procesos que ocurren a nivel de la envuelta del VIH-1 mediante técnicas de microscopía avanzada, que han permitido la cuantificación de diferentes parametros biofísicos. En primer lugar se ha analizado el grado de empaquetamiento de bicapas lipídicas en vesículas unilamelares gigantes utilizando microscopía de dos fotones de la sonda fluorescente Laurdan, que permite, mediante la función GP, cuantificar el orden molecular de una membrana. Durante la implementación de esta técnica e inicialmente como método de validación de la misma, se ha construido un diagrama de fases de GP de la mezcla lipídica DOPC:colesterol:esfingomielina. Además se han identificado ciertas fuentes de segregación lateral artefactual, que se pueden evitar mediante la excitación por dos fotones, por ejemplo, la fotooxidación. El diagrama de fases puede ser utilizado como herramienta para definir mezclas lipídicas que emulen una membrana biológica deseada.Para definir la organización y función de la membrana viral, se ha extraído el contenido lipídico de virus infectivos. Estas mezclas lipídicas han sido reconstituidas en vesículas unilamelares gigantes y monocapas Langmuir-Blodgett para analizar su grado de orden molecular y comportamiento de fases. La determinación del nivel de empaquetamiento ha permitido el desarrollo de mezclas lipídicas que emulan la membrana viral y han sido utilizadas en los capítulos posteriores como modelo de la envuelta lipídica. Mediante microscopía de fuerza atómica se ha demostrado que la membrana viral puede organizarse en nanodominios. También se ha analizado el efecto de compuestos virucidas que actúan a nivel de membrana en los citados parametros biofísicos. Los resultados obtenidos sugieren que un agente capaz de interferir con la nanoorganización de la membrana viral podría inhibir la infección.Basado en estas evidencias se ha procedido al estudio del mecanismo de inhibición mediada por péptidos derivados del dominio MPER de la proteína gp41 del VIH-1. Únicamente un péptido cuya secuencia comprende el dominio MPER y parte del dominio TMD ha presentado actividad virucida (MPER671¿693). A pesar de que otros péptidos son también capaces de alterar la nanoorganización de membranas modelo, sólo MPER671¿693 parece estructurarse en los límites de dominios lipídicos y presentar la capacidad de inducir permeabilización de membranas modelo, dos procesos que parecen estar relacionados con su actividad virucida.Por último, se ha estudiado el mecanismo de unión de anticuerpos de amplio espectro anti-MPER directamente a viriones utilizando microscopía de fluorescencia de superresolución. De este modo, se ha determinado que los anticuerpos anti-MPER y anti-gp120 reconocen el mismo tipo de agrupaciones de Env en la membrana viral. Además se ha establecido una correlación entre la unión y la neutralización en el caso de los anticuerpos anti-MPER 4E10 y 10E8, que parece depender de la capacidad de establecer interacciones con lípidos, aunque en ningún caso se ha observado una interacción directa entre 4E10 o 10E8 y la membrana viral. Experimentos de espectroscopía de correlación de fluorescencia realizados utilizando membranas modelo sugieren que la interacción entre 4E10 y la membrana es superficial e inespecífica, además de estar impedida debido al alto empaquetamiento de la envuelta lipídica.En conclusión, los estudios de microscopía avanzada realizados durante esta tesis han permitido la caracterización y mayor comprensión de la membrana del VIH-1 y del mecanismo de inhibición y neutralización de compuestos y anticuerpos anti-VIH en el contexto de la membrana viral.