Caracterización estructural de complejos ribosomales de iniciación y de pre-translocación mediante microscopía electrónica

Resum

Los ribosomas son complejos macromoleculares altamente organizados responsables de la síntesis de proteínas en todos los organismos en un proceso llamado traducción. El término traducción hace referencia a que el lenguaje en el que está codificado el material genético escrito en la secuencia del ARNm (ARN mensajero), es traducido al lenguaje de los aminoácidos constituyentes de las proteínas. Es por ello que los ribosomas son componentes esenciales ya que en su ausencia las células serían incapaces de sintetizar las proteínas que necesitan para su correcto funcionamiento. Además, conocer la manera en la que actúan estos motores celulares proporciona una información muy valiosa para futuras terapias como los antibióticos. El proceso de traducción ribosomal se divide conceptualmente en 4 etapas. En la etapa de iniciación, el ARNm y el ARNt iniciador se unen al ribosoma con la ayuda de los distintos factores ribosomales en el sitio P, creando la interacción codón-anticodón. La etapa de elongación hace referencia a la polimerización del péptido. Por último, las etapas de terminación y reciclaje, incluyen una secuencia de eventos que siguen el reconocimiento del codón de terminación en el ARNm y que concluye con la cadena polipetídica liberada del ribosoma y sus subunidades desensambladas. El estudio de la estructura y funcionamiento de los ribosomas durante la traducción ha tenido un gran impulso gracias al desarrollo de técnicas de biología estructural como la microscopía electrónica y la cristalografía. En este proyecto, utilizamos una metodología basada en la crio-microscopía electrónica y reconstrucción tridimensional para estudiar diferentes estados que experimenta el ribosoma a lo largo del proceso de traducción. Complementariamente, para analizar diferencias conformacionales que se dan en la misma muestra nos apoyamos en un método de clasificación basado en procedimientos estadísticos de máxima verosimilitud. Los complejos con los que trabajamos pertenecen a las etapas de iniciación y elongación. El primer objeto de estudio es el complejo de pre-translocación. El proceso de translocación se produce durante la elongación, y en ella, los ARNts y el ARNm se mueven a través del ribosoma entre sus sitios A (aminoacil), P (peptidil) y E (exit) para permitir la lectura del siguiente codón del ARNm. Después de la transferencia del péptido entre los ARNts se acompaña de un movimiento rotacional entre subunidades de un gran movimiento del tallo L1. Utilizando crio-microscopía electrónica y clasificación conseguimos capturar este estado intermedio que no había sido posible visualizar hasta entonces. Con estos resultados mostramos que los complejos ribosomales de pre-translocación pueden adoptar espontáneamente tanto el estado híbrido (A/P y P/E) con rotación relativa de subunidades como el estado clásico (A/A y P/P) sin rotación relativa entre subunidades. Además, la posición del ARNt híbrido en el sitio A indicaba que el extremo aceptor del peptidil-ARNt es desplazado hacia el sitio P de la subunidad 50S a través de la rotación de la subunidad 30S, induciendo pequeños cambios en la configuración de su brazo aceptor. El siguiente objeto de nuestro estudio es el complejo de iniciación 30S (30SIC) completo, que no había sido caracterizado estructuralmente con anterioridad. En él aparecen los factores de iniciación 1(IF1), 2(IF2) y 3(IF3); el ARNm y el ARNt iniciador sobre la subunidad ribosomal 30S. Una de las características que revela la caracterización estructural de este complejo es la posición de IF3 sobre la plataforma de la subunidad 30 bloqueando un importante puente de unión con la subunidad 50S. Este efecto bloqueante de IF3 en el complejo concuerda con el hecho de que el mRNA utilizado en este estudio, concretamente su región de iniciación de la traducción (TIR), provoca un ensamblaje de la subunidad 50S menor que el que se obtiene al utilizar otros mRNAs.