Búsqueda e identificación de nuevas causas genéticas o epigenéticas de trastornos del neurodesarrollo

Zusammenfassung

Los trastornos del neurodesarrollo engloban desordenes cognitivos, de aprendizaje, comportamiento, comunicación y motores, que aparecen en edad temprana, como la discapacidad intelectual (DI) o los trastornos del espectro autista (TEA). Se trata de patologías complejas, debidas a alteraciones en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC), que pueden presentan agregación familiar o asociarse a otras anomalías congénitas o rasgos dismórficos. Pese a que la causa de este tipo de trastornos en muchos casos es desconocida, existen claras evidencias sobre sus bases genéticas, con un gran número de síndromes descritos que cursan con DI asociados a diversas variantes en número de copias (CNVs) o alteraciones epigenéticas. El desarrollo del sistema nervioso, la plasticidad neuronal o la organización sináptica son procesos dinámicos modulados por la epigenética, que actúa de mediador entre el medio ambiente al que nos vemos expuestos y cuyo receptor principal es el SNC, y la información contenida en los genes. Las alteraciones de estos mecanismos pueden ser génicas, al afectar a la secuencia de genes que codifican para proteínas que participan en estos procesos; o epigenéticas, al producirse cambios en las señales epigenéticas sin alteración de la secuencia del ADN. En base a esto, el presente trabajo pretende contribuir al conocimiento de la etiología y al diagnóstico genético de los trastornos del neurodesarrollo. Por un lado, mediante la búsqueda de alteraciones genéticas relacionadas con este tipo de trastornos, tanto en genes implicados en la regulación epigenética, la diferenciación y el desarrollo del SNC, como en elementos del genoma que puedan intervenir en la regulación de la expresión génica, principalmente elementos ultraconservados (UCEs) y miRNAs. Y por otro lado, con la búsqueda de alteraciones epigenéticas, centrándonos en la metilación del genoma completo y de regiones candidatas de interés, tales como dominios sometidos a metilación diferencial. Para ello se han utilizado distintas aproximaciones en una serie de 395 pacientes con DI y/o TEA de etiología desconocida que presentan además anomalías congénitas, rasgos dismórficos y/o distintos antecedentes familiares que puedan estar relacionados con estos trastornos. En el rastreo del genoma en busca de alteraciones genéticas se ha empleado como herramienta el CGH-array, utilizando, tanto uno comercial (4X44K, G4426B, Agilent Technologies) como otro de diseño propio, específico para este trabajo, centrado en genes y regiones de interés en los trastornos del neurodesarrollo. Los resultados obtenidos por ambas estrategias fueron confirmados por diversas técnicas (marcadores microsatélites, MLPA, PCR cuantitativa o FISH). Además se realizó un rastreo de mutaciones en el gen candidato MYT1L, mediante heterodúplex, en una serie de 69 pacientes clínicamente seleccionada, confirmando los resultados obtenidos por secuenciación. Para el rastreo de cambios en la metilación global del genoma se realizó, en un total de 17 pacientes con alteración conocida en algún gen epigenético y 33 controles, un estudio piloto mediante HPLC, método de referencia para esta determinación. Para el rastreo en regiones específicas, en toda la serie de pacientes, se seleccionaron 4 loci sometidos a impronta (KCNQ1OT1, H19, SNRPN y MEG3) utilizando un protocolo basado en el tratamiento con enzima de restricción sensible a metilación y PCR múltiple semicuantitativa, confirmando los resultados obtenidos mediante marcadores microsatélite, para poder valorar posibles disomías uniparentales, o MS-MLPA. Los estudios genéticos realizados mediante array han permitido detectar 220 cambios de dosis en 152 pacientes, siendo 58 de ellos portadores de alguna CNV claramente causal. Entre el 29 y el 50 % de los pacientes con un cambio de dosis patológico tienen afectado algún gen de la maquinaria epigenética cuya alteración tiene repercusión clínica. Además se observó un enriquecimiento significativo en genes epigenéticos en CNVs patológicas, en contraposición con un empobrecimiento de este tipo de genes entre las CNVs benignas. Los resultados obtenidos confirman la importancia de los genes responsables de los procesos epigenéticos en el neurodesarrollo, y su sensibilidad a los cambios de dosis. Sin embargo, no se han detectado alteraciones causales que afecten exclusivamente a UCEs o miRNAs, aunque se ha obtenido un enriquecimiento significativo de estos elementos en CNVs patológicas, lo que sugiere que la desregulación de la expresión génica, mediada por este tipo de elementos, podría suponer un factor de predisposición para los trastornos del neurodesarrollo. Para intentar explicar los mecanismos que han dado lugar a las CNVs, detectadas en este trabajo, se hizo un análisis de las zonas de incertidumbre donde se localizan los puntos de rotura, observándose en esas regiones un enriquecimiento significativo en secuencias repetitivas, genes y lincRNAs. Estos elementos podrían participar en la formación de los reordenamientos cromosómicos de distintas formas. Las duplicaciones segmentarias y los elementos Alu, podrían intervenir directamente en los complejos mecanismos que generan estos reordenamientos (NAHR, NHEJ o FoSTeS). Por otra parte, las secuencias que se transcriben, pueden ser vulnerables a sufrir roturas, al descondensarse la cromatina y verse expuestos durante su transcripción, en etapas clave como la gametogénesis o estadios tempranos del desarrollo embrionario. Asimismo, el enriquecimiento en genes de los puntos de rotura podría favorecer la formación de genes quimera cuya contribución al fenotipo ayudaría a explicar las diferentes consecuencias fenotípicas de deleciones o duplicaciones aparentemente equivalentes. En este sentido, se ha estimado que en nuestra serie un 60 % de las deleciones con zona de incertidumbre inferior a 315 Kb podría formar un gen quimera, confirmándose además la formación de transcritos de fusión en los únicos tres casos estudiados experimentalmente. En cuanto a la aplicación de un diseño específico de array para los trastornos del neurodesarrollo, con una alta densidad de sondas en genes y regiones con valor clínico demostrado y una selección de sondas genómicas que permitan una buena resolución a lo largo de todo el genoma, nuestros resultados indican que se trata de una estrategia adecuada para detectar tanto alteraciones intragénicas como CNVs patológicas de mayor tamaño. No obstante, el número de alteraciones intragénicas patológicas detectadas es minoritario, mientras que las benignas representan un alto porcentaje, por lo que el rendimiento diagnóstico del array para este tipo de alteraciones puede ser bajo. Sin embargo, las CNVs intragénicas en genes candidatos de DI pueden ayudar a aclarar la contribución de estos genes en los trastornos del neurodesarrollo. Además, los distintos resultados obtenidos en relación al gen MYT1L, junto con la información disponible en la bibliografía permiten aseverar que su haploinsuficiencia causa discapacidad intelectual frecuentemente asociada a autismo, siendo la obesidad un rasgo mucho menos frecuente de lo que inicialmente se indicaba, que puede deberse a otros factores como la alteración de diferentes genes de la región. Por otro lado, los estudios de metilación global no permitieron encontrar diferencias significativas entre el grupo de pacientes con DI y alteración genética conocida en genes implicados en la regulación epigenética frente al grupo control de individuos sanos, probablemente debido a la multitud de factores endógenos, exógenos y de diseño experimental que pueden modificar estos valores, por lo que la utilidad clínica de esta estrategia como marcador de un trastorno de la maquinaria epigenética en pacientes con DI no ha sido validada. Sin embargo, el rastreo en loci conocidos sometidos a impronta ha permitido diagnosticar a 5 pacientes, mostrando además evidencias en dos de ellos de sendos nuevos síndromes de impronta, por lo que el estudio de los patrones de metilación de distintas regiones improntadas conocidas, en ADN obtenido de sangre periférica, puede servir de marcador de nuevos síndromes de impronta causados por alteraciones epigenéticas multi-loci. Con los resultados de este trabajo ha quedado demostrado que dentro de las causas genéticas responsables de los trastornos del neurodesarrollo, el fenotipo de los pacientes con DI idiopática puede deberse a una combinación de factores que incluyen, reordenamientos genómicos, mutaciones puntuales o alteraciones epigenéticas, lo que dificulta la valoración clínica inicial de estos pacientes y la orientación de los estudios genéticos pertinentes. Por lo que en estos casos, realizar una completa evaluación de estos factores, permite aumentar la probabilidad de llegar a un diagnóstico certero que posibilite un correcto asesoramiento a las familias.