Developing ferrite based nanocompounds for biomedical applications

Zusammenfassung

La falta de especificidad de muchos tratamientos, tales como la quimioterapia o la radioterapia para tratamientos de cáncer, son el mayor obstáculo para la curación de dichas enfermedades. Tales tratamientos suelen requerir dosis mucho mayores de las en principio necesarias para contrarrestar su falta de especificidad, además de los numerosos efectos secundarios que causan, los cuales a menudo impiden su aplicación. Por ello, el desarrollo de nuevos tratamientos específicos para este tipo de enfermedades es uno de los principales retos que la investigación se ha marcado actualmente.En las nanopartículas magnéticas (MNP) superparamagnéticas se ha encontrado una opción potencial para solucionar estos problemas. Por una parte, estas nanopartículas podrían usarse como vehículo para transportar fármacos a las zonas deseadas para liberarlos allí, aumentando así su efectividad. Esto permitiría reducir las dosis de estos fármacos, reduciendo a su vez sus efectos secundarios. Además, dichos materiales son capaces de generar calor al verse afectados por un campo magnético alterno, mediante un fenómeno denominado hipertermia magnética. De esta manera, las partículas podrían dirigirse a la zona tumoral, aplicándole entonces un campo magnético alterno para calentar de forma controlada la zona a tratar, matando así las células cancerígenas mediante apoptosis celular. Para alcanzar tales objetivos, hay tres pasos fundamentales que deben llevarse a cabo. 1: el desarrollo de un material magnético nanoestructurado que reúna las condiciones necesarias para generar un gran efecto de hipertermia magnética. 2: modificar la superficie de dicho material para hacerlo biocompatible y funcionalizarlo dependiendo del proceso al que vaya destinado, así como adherir los fármacos a transportar. 3: comprobar su toxicidad mediante ensayos in vitro e in vivo. En esta tesis se ha transcurrido por cada uno de estos tres pasos, desarrollando dos materiales con potenciales aplicaciones biomédicas.Inicialmente, se han sintetizado nanopartículas magnéticas (MNP) de ferrita (MxFe3-xO4) dopada con cationes de Ni2+ o Mn2+, así como distintos sistemas core shell alternando capas de ferrita de níquel y magnetita. El motivo de la formación de estas ferritas dopadas y estos sistemas core shell es la posibilidad de obtener valores de hipertermia mayores a los obtenidos con la magnetita (Fe3O4), que es el material usado normalmente. Dichos procesos se han llevado a cabo mediante el método de descomposición térmica de precursores metalorgánicos, que consiste en el calentamiento de dichos precursores a altas temperaturas en disolventes orgánicos de alto punto de ebullición y en presencia de ligandos orgánicos. De esta forma, se han obtenido MNPs con tamaños comprendidos entre 8-12 nm. Dado que el tamaño de partícula es un parámetro fundamental para la respuesta de hipertermia, una muestra de cada grupo (ferritas de Ni y ferritas de Mn) ha sido recrecida mediante un método de crecimiento por etapas a partir de semillas de MNPs. Dicho método se basa en la repetición del proceso de formación de las partículas sobre semillas de MNP previamente sintetizadas, aumentando así el tamaño de estas semillas. Los sistemas de core shell también han sido sintetizados mediante este método, alternando capas de diferentes materiales en cada proceso de crecimiento. La caracterización química y estructural ha mostrado que los cationes con los que se ha dopado la ferrita están presentes en las muestras, obteniendo partículas esféricas superparamagnéticas monodominio con una morfología bien definida y cubiertas de cadenas de oleato, lo que estabiliza las partículas en dispersiones coloidales en medio orgánico (apolar). La caracterización magnética ha mostrado que a grados de dopaje mayores de ambos metales la imanación de saturación, a la vez que la constante magnetocristalina,tienden a decrecer. Esto da una idea de a qué tipo de huecos tiende a ir cada catión, lo que ayuda la comprensión del comportamiento de este tipo de materiales. Del mismo modo, mediante la espectroscopia magnética de resonancia (EMR) se ha comprobado que los tamaños de partícula mayores inducen valores mayores del factor giromagnético efectivo (geff), lo que es muestra de un mayor comportamiento ferromagnético. Las medidas de hipertermia de todas las muestras han confirmado que el sistema que tiene mayor diámetro, constante magnetocristalina e imanación de saturación es el que da la mayor señal de hipertermia magnética (Ni0.31Fe2.69O4_A). Dicha muestra ha mostrado una respuesta de hipertermia mayor que la de MNP de magnetita de tamaño equivalente. Por ello, esta muestra ha sido seleccionada para continuar con el siguiente paso.Tal y como se ha comentado, dichas nanopartículas son hidrófobas, y requieren una funcionalización para ser estables en medio fisiológico. En la segunda fase del trabajo, el sistema optimizado en el paso anterior (Ni0.31Fe2.69O4_A) ha sido funcionalizado de dos formas distintas, obteniendo dos tipos diferentes de material que están destinados a una aplicación distinta. Por una parte, las nanopartículas se han recubierto individualmente con el polímero poly(maleic anhydride-alt-1-octadecene) (PMAO) (Ni0.31Fe2.69O4_A_PMAO). De esta forma, las partículas han sido estabilizadas en medio acuoso, obteniendo una carga superficial negativa y siendo destinadas a tratamientos basados en la hipertermia magnética. La presencia de este polímero ha sido demostrada por medidas del diámetro hidrodinámico y de termogravimetría. Dichas partículas no han sufrido cambios en sus propiedades magnéticas en comparación con las partículas recubiertas de oleato (Ni0.31Fe2.69O4_A).Por otra parte, se ha desarrollado un nuevo mecanismo para encapsular las nanopartículas en el biopolímero quitosano. Dicho método ha sido optimizado y está basado en la formación de múltiples interacciones hidrófobas entre las cadenas de oleato de la superficie de las NP y el quitosano, seguido de un proceso de coacervación que incremente las interacciones electrostáticas, dotando a las nanoesferas finales de una mayor rigidez. De esta forma, se han obtenido nanoagregados estables de 90 nm de las nanopartículas en este biopolímero de carga positiva (CS-MNS). Al contrario que en la anterior funcionalización, en este caso hay diferencias estructurales y magnéticas notables comparadas con la muestra de MNP de partida. A pesar de que se ha mantenido la imanación de saturación y, aparentemente, las nanoesferas siguen teniendo un comportamiento superparamagnético a temperatura ambiente, la agregación ha inducido interacciones dipolares entre las MNP adyacentes, lo que resulta en un comportamiento más ferromagnético. Los estudios de encapsulación de fluoróforos que se le han realizado, a la vez que los estudios de estabilidad ante diferentes medios, muestran que estas nanoesferas resultan muy apropiadas para el transporte de fármacos.En el último paso de esta tesis se analiza la toxicidad de estos dos nanosistemas, Ni0.31Fe2.69O4_A_PMAO y CS-MNS. Primero, se ha analizado su citotoxicidad en monocultivos de la línea Vero, poniendo los nanosistemas en contacto con dichos monocultivos durante 24 horas. Los resultados de citotoxicidad obtenidos han demostrando que ninguno de los dos sistemas muestra citotoxicidad en estos cultivos en exposiciones de 24 horas, en las concentraciones testadas (0-0.5 mg/mL). Tras ello, ambos sistemas se han puesto en contacto con un modelo de vaso sanguíneo preparado mediante células endoteliales y macrófagos. En este caso no se ha comprobado sólo la citotoxicidad de los materiales, habiendo comprobado más en profundidad su posible toxicidad. Mediante este experimento se ha demostrado que las nanopartículas individuales Ni0.31Fe2.69O4_A_PMAO penetran en mayorcantidad en las células que las nanoesferas, debido a su menor tamaño. Ninguno de los dos compuestos muestra ningún tipo de toxicidad (estrés oxidativo, cambios en la morfología celular,...) a excepción de una leve respuesta inflamatoria, que no repercute en gran medida en el metabolismo celular normal, ni tendría que generar ningún efecto visible. Finalmente, se ha analizado el efecto de la muestra CS-MNS en ratones, exponiéndola durante 48 horas. En este caso, además de la toxicidad de las nanoesferas en los ratones, se ha determinado también la biodistribución de éstas por los diferentes órganos. No se ha observado ningún cambio notorio en el peso de los ratones o de alguno de sus órganos debido a la exposición, al margen de un decrecimiento inicial del peso debido al shock derivado de la inyección. En los análisis de sangre sólo se ha observado un leve aumento en los niveles de la encima aspartato aminotransferasa (AST), que podría estar relacionado con daños en el tejido hepático. Sin embargo, el aumento de los niveles de AST no es lo bastante grande como para poder relacionarse con daños severos. La biodistribución de las nanoesferas por los diferentes órganos de los ratones se ha analizado mediante espectroscopía de plasma inductivo (ICP), midiendo las concentraciones de los metales Fe y Ni en los diferentes órganos. En este análisis se ha observado una mayor presencia de las nanoesferas en el hígado, que podría estar filtrando las nanoesferas del flujo sanguíneo.En conclusión, en estas tesis se han desarrollado dos sistemas nanoestructurados destinados a aplicaciones biomédicas (hipertermia magnética, y transporte de fármacos). Sus propiedades, tanto estructurales como magnéticas, los hacen viables para dichas aplicaciones, ya que no han mostrado una alta toxicidad en los ensayos preclínicos realizados.