Activación de la microglía inmadura y muerte neuronal durante el desarrollo de la retina de codorniz

Resum

La activación de las células microgliales maduras en respuesta a un daño o patología del sistema nervioso central (SNC) es un proceso bien caracterizado que se manifiesta morfológicamente mediante la transición de un estado ramificado a un fenotipo redondeado, similar al de los macrófagos. Sin embargo, el proceso de activación de la microglía inmadura (ameboide) durante el desarrollo embrionario es mucho menos conocido y solo ha empezado a cobrar protagonismo en los últimos años (Cunningham et al., 2013; Arnoux et al., 2013). El presente estudio ha analizado la activación de la microglía ameboide durante el desarrollo de la retina de codorniz y su participación en la muerte de células ganglionares. La semejanza morfológica entre la microglía ameboide durante el desarrollo normal del SNC y la microglía activada en el SNC adulto en situación patológica sugiere que la microglía ameboide ya tiene un cierto grado de activación, que hemos denominado activación basal (Sierra-Martín et al., 2014), inducido por señales del propio microambiente existente en el SNC inmaduro. La expresión de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) es considerada como uno de los principales marcadores de activación microglial. En el presente estudio se ha demostrado que iNOS se expresa en la retina de codorniz desde etapas tempranas del desarrollo embrionario hasta la edad adulta. El inmunomarcaje de iNOS disminuye significativamente cuando la microglía ameboide de la retina embrionaria se diferencia en microglía ramificada, confirmando que la microglía ameboide tiene un nivel de activación basal durante el desarrollo normal de la retina de codorniz. La microglía ameboide en estado de activación basal es capaz de incrementar su nivel de activación, que hemos denominado sobreactivación, en respuesta a diferentes estímulos que producen daño en el SNC inmaduro (Czeh et al., 2011; Ferrazzano et al., 2013). El lipopolisacárido bacteriano (LPS) es un potente activador de la microglía (Block et al., 2007; Calderó et al., 2009; Neher et al., 2011). En la presente Tesis, se ha utilizado el LPS como inductor de la sobreactivación de la microglía ameboide en un modelo de estudio puesto a punto con anterioridad en nuestro laboratorio, consistente en cultivos organotípicos de explantes de retina de embriones de codorniz de 8 días de incubación, en los que la microglía ameboide muestra un comportamiento fisiológico, similar al observado en la retina in situ. Nuestros resultados demuestran que el tratamiento con LPS de explantes de retina cultivados in vitro induce importantes cambios morfológicos en la microglía ameboide, así como un significativo incremento de su compartimento lisosómico y de la expresión de iNOS. Estos resultados confirman la sobreactivación de la microglía ameboide inducida por la acción del LPS. El óxido nítrico producido por la iNOS puede contribuir tanto a la supervivencia, como a la muerte neuronal, dependiendo de su concentración y del estado de oxidación celular (Brown, 2010; Kang et al., 2004). La microglía ameboide migra tangencialmente en la retina embrionaria de codorniz en estrecha relación con las células ganglionares (Navascués et al., 1995). En el presente estudio se han analizado los efectos del óxido nítrico producido por la microglía ameboide sobreactivada con LPS sobre la muerte de células ganglionares en los explantes de retina embrionaria cultivados in vitro. Nuestros resultados demuestran que la microglía inmadura sobreactivada induce un incremento en la muerte de células ganglionares. Además, el tratamiento con LPS de los explantes de retina provoca un incremento de los contactos fagocíticos entre células microgliales sobreactivadas y células ganglionares en fases tempranas de la apoptosis, sugiriendo que el mecanismo de eliminación apoptótica de las células ganglionares está mediado por la fagocitosis microglial. Por otra parte, la inhibición de la actividad de iNOS revierte los efectos del LPS, provocando una significativa disminución de la producción de especies reactivas de oxígeno en las células microgliales ameboides y de la apoptosis de células ganglionares. Estos resultados demuestran que el óxido nítrico producido por la iNOS de la microglía sobreactivada juega un papel en el mecanismo de apoptosis de células ganglionares inducida por LPS. En conjunto, la presente Tesis permite concluir que la sobreactivación de la microglía activada provoca una disminución del número de células ganglionares mediante un mecanismo de muerte celular promovida por fagocitosis microglial, en el que la producción de óxido nítrico juega un papel preponderante.