Estudio del papel funcional de dupa7, un duplicado parcial de la subunidad nicotinica a7 humana. Implicacion en el control de la respuesta inflamatoria

Résumé

En 1998 Gault y cols. descubrieron que los 5 últimos exones de la subunidad nicotínica ¿7 humana se encontraban duplicados a una distancia de 1,6 Mb hacia la región centromérica del mismo cromosoma. Además, junto a estos 5 exones se detectó otro fragmento identificado como FAM7A, y se pudo constatar que se transcribían en un único producto, por lo que a este nuevo gen se le denominó CHRFAM7A, y o subunidad dup¿7. Estudios posteriores han podido comprobar que esta duplicación aparece en la mayoría de la población, aunque no siempre, y que se trata un de un fenómeno exclusivo de humanos. Mediante el análisis de la región cromosómica, en la que se encuentra ubicado el gen, 15q13-14, se ha podido comprobar que presenta gran complejidad ya que se ha encontrado en las dos orientaciones y además, presenta otros polimorfismos relacionados con la secuencia, entre los que destacan una delección de 2 pb en el exón 6. Hasta la fecha se ha hallado el ARNm de esta subunidad en diferentes regiones del cerebro, en células del sistema inmune, en sinoviocitos y en la línea celular HL-60. La mayoría de los estudios que se han realizado acerca de esta duplicación se basan fundamentalmente en el análisis genético y su asociación con diversas patologías neuropsiquiátricas, sin embargo aun no ha sido posible determinar si el ARNm de este gen se traduce a proteína, y en el caso de producirse, si tendría alguna función. En este trabajo hemos identificado el ARNm de la subunidad dup¿7 en CMSP y en macrófagos y la hemos clonado mediante técnicas básicas de biología molecular. En células HL-60 hemos comprobado la existencia de ARNm unido a polisomas obtenidos mediante fraccionamiento en gradiente de sacarosa, lo que demuestra la realización de la traducción en este tipo celular. Asimismo, utilizando técnicas de inmunofluorescencia y marcaje específico hemos constatado la traducción in vitro de dup¿7 mediante su expresión en dos sistemas heterólogos diferentes, en células GH4C1 y en ovocitos. Por otro lado, el empleo de técnicas de electrofisiología de fijación de voltaje con dos electrodos en ovocitos de X. laevis inyectados con ARNm de ¿7 y dup¿7 nos ha permitido observar que la subunidad dup¿7 ejerce un efecto dominante negativo sobre el receptor homomérico ¿7 de una manera dosis dependiente. Este efecto es producido fundamentalmente por la retención en el retículo de ¿7 impidiendo la traslocación de receptores funcionales a la membrana de los ovocitos. Asimismo, se ha podido comprobar que la expresión del ARNm de la subunidad dup¿7 puede ser modulada en macrófagos en cultivo tras el tratamiento de los mismos con diversas sustancias endógenas y exógenas como la nicotina, la citoquina pro inflamatoria iL1ß, y el LPS. En los tres casos se produjo la disminución de la expresión del gen tras el tratamiento.