Identificación y cuantificación de especies del género Merluccius mediante la utilización de PCR a tiempo real

Resum

Desde los años 60 se ha venido planteando la resolución de la problemática del correcto etiquetado de las especies pesqueras presentes en la amplia variedad de los productos de la pesca y como abordar la aplicación de protocolos de trazabilidad en este tipo de productos. Con este fin se han desarrollado normativas específicas para el etiquetado de los diversos productos comerciales de pescado. A lo largo de los años las normativas se han ido modificando de manera que no sólo incluyen la regulación del etiquetado de las especies, esto es, la identificación de las especies presentes en el producto, sino también la obligatoriedad de incluir en el etiquetado la cantidad de cada una de las especies empleadas en el producto. La necesidad de cumplir con estos requerimientos legales hace necesario disponer de técnicas de autentificación para los productos pesqueros. La técnica más sencilla de autentificación de especies de pescado es la inspección visual. Este tipo de identificación presenta el inconveniente de que sólo se puede realizar en ejemplares que presenten sus caracteres morfológicos intactos. Sin embargo, cada vez es mayor la cantidad de productos procesados carentes de caracteres morfológicos que permitan su identificación. En los últimos años los métodos más aplicados en la identificación de especies en alimentos se basan en el análisis de ADN. En la actualidad se ha incorporado la técnica de la PCR a tiempo real a esta práctica, ya que presenta la ventaja de permitir una identificación de especies en productos donde hay más de una especie. En la PCR a tiempo real es posible la monitorización continua de todo el proceso de amplificación gracias a la incorporación de un elemento de emisión de fluorescencia, por lo que es posible comparar distintas muestras en función de la fase exponencial, cuando la eficiencia es máxima, en vez de a punto final como ocurre con la PCR convencional. El fundamento de la PCR a tiempo real radica en la existencia de una correlación entre la señal de fluorescencia emitida durante el proceso de la PCR y la cantidad de ADN molde (diana para esa PCR). Existen distintos métodos matemáticos que transforman esa señal de fluorescencia en datos de cuantificación absoluta o relativa del fragmento de ADN amplificado. Por lo tanto con esta técnica es posible tanto la identificación de una especie como su cuantificación. En esta memoria se describe el diseño de distintos sistemas de PCR en tiempo real (sondas TaqMan-MGB) específicos de las especies más importantes desde el punto de vista comercial del género Merluccius y Macruronus, empleando para ello alineamientos de secuencias mitocondriales y nucleares. Del mismo modo se aplicaron distintas ecuaciones sigmoideas para el ajuste del perfil de datos de fluorescencia obtenidos en cada una de las reacciones de PCR, obteniendo el mejor ajuste con la ecuación de Richards con 4 parámetros. A partir de dicha ecuación se seleccionó el parámetro ¿c como sustituto del valor Ct, método ¿Threshhold¿, por ser menos sensible al error experimental. Una vez descritos los perfiles cinéticos se llevó a cabo la evaluación de la eficiencia y la capacidad identificativa (especificidad) de seis de los sistemas TaqMan-MGB diseñados. Se obtuvieron buenos resultados de especificidad para la mayoría de los sistemas a excepción del sistema MMER, uno de los dos sistemas diseñados para la especie M. merluccius ya que presentó reacción cruzada con la especie M. capensis. La aplicación del sistema MMER_VIC, específico de la especie M. merluccius, en muestras comerciales permitió discriminar las muestras M. merluccius de las que no lo eran sin obtener falsos positivos. Posteriormente, se evaluó la capacidad cuantitativa, tanto relativa como absoluta, de cuatro sistemas, tres de género (MAC, HAKE y MLL) y uno especie-específico (MMER_VIC) en mezclas modelo de diversa complejidad obteniendo unos resultados de cuantificación ajustados de manera significativa a lo esperado, tanto en cuantificación absoluta como relativa e independientemente de la complejidad de las muestras.