Patrones de glicosilación y reconocimiento por lectinas

Resum

La matriz extracelular y el glicocálix, que se localiza en el exterior de la membrana de células eucariotas, patógenos o incluso vesículas extracelulares, se caracterizan por presentar una alta densidad de glicanos. Una colección de enzimas se encarga de su síntesis y modificación de manera dinámica, confiriendo a las células la capacidad de adaptarse constantemente a su entorno. A pesar de esta adaptación, existen ciertos patrones de glicosilación que constituyen una huella dactilar, identificativa de su portador. Las lectinas constituyen una precisa maquinaria que hace el glicocódigo operativo, uniendo carbohidratos selectiva y reversiblemente. Los patrones de glicosilación de bacterias pueden contener carbohidratos ajenos a los del glicocálix de las células eucariotas, si bien también pueden imitar a los del huésped con el fin de evitar su reconocimiento por lectinas endógenas y así evadir la respuesta inmune. En paralelo, el descubrimiento de que las vesículas extracelulares, secretadas por casi todo tipo de células, comparten patrones de glicosilación con su célula de origen, ha planteado su posible uso como biomarcadores. De todo lo anterior se desprende que la caracterización de los patrones de glicosilación de diferentes tipos de células puede ayudar al establecimiento de correlaciones funcionales. Con este fin, es necesario desarrollar nuevas metodologías analíticas de alto rendimiento que integren el uso de lectinas como herramientas únicas de descodificación. En esta Tesis, se han diseñado, validado y aplicado novedosas estrategias para el glicofenotipado de distintas sondas y para la evaluación de compuestos capaces de impedir la unión de adhesinas bacterianas a carbohidratos de las células huésped, empleando las tecnologías de microarrays y microgravimetría de cristal de cuarzo, QCM. Se han empleado bacterias y vesículas enteras, preservando de esta forma el entorno y densidad natural de las biomoléculas examinadas. Los patrones de glicosilación de distintas cepas de Haemophilus influenzae no tipificable, NTHi, se han identificado mediante ensayos de unión a microarrays de esta bacteria de un panel de lectinas con diferentes especificidades de unión. Se han observado patrones de glicosilación específicos para diferentes aislados clínicos de NTHi y mutantes isogénicos de la cepa modelo NTHi375 que presentan un lipooligosacárido, LOS, truncado. Los resultados han demostrado la presencia en la superficie de la bacteria de estructuras de carbohidrato que son reconocidas por lectinas endógenas. Asimismo, se han obtenido los parámetros cinéticos de la unión a NTHi de lectinas seleccionadas, usando novedosos sensores de QCM que incorporan la bacteria entera. La identificación del LOS como ligando de ciertas lectinas ha dado paso a su análisis estructural por Resonancia Magnética Nuclear y a la identificación a nivel atómico de los epítopos reconocidos. En paralelo, se han fraccionado y caracterizado diferentes preparaciones de vesículas extracelulares, y su glicofenotipado se ha llevado a cabo utilizando microarrays de diseño y el mismo panel de lectinas de especificidad definida. Además se ha diseñado un método para la detección de exosomas en flujo y se han realizado estudios cinéticos por QCM de interacciones vesícula-lectina. Por último, en el campo de terapias anti-adhesión, se han desarrollado microarrays que permiten evaluar la funcionalidad de FimH, una adhesina de Escherichia coli que interviene en la infección de epitelios humanos, empleando bacterias vivas, y la valoración de glicofulerenos como posibles inhibidores de la adhesión. La plataforma se ha validado empleando concanavalina A como lectina modelo, y los resultados obtenidos se han confirmado mediante resonancia de plasmón de superficie y calorimetría de valoración isoterma.