Structure-function relationships in intracellular and secreted pulmonary surfactant complexesdevelopment and implementation of cellular models

Résumé

El surfactante pulmonar (SP) es un complejo lipoproteico esencial, cuya principal función es la disminución de la tensión superficial en la interfase aire-líquido de los alvéolos, evitando su colapso al final de la espiración. El SP está constituido por un 90% de lípidos y un 10% de proteínas específicas y es producido y secretado por las células alveolares tipo II (ATII), un tipo celular especializado del epitelio alveolar. Previamente a la exocitosis del surfactante, éste es almacenado en orgánulos especiales de las células ATII denominados cuerpos lamelares (Lamellar Bodies, LBs). En la presente tesis doctoral se ha estudiado la organización estructural micro- y nanoscópica de las membranas de SP almacenadas intracelularmente como LBs en cultivos primarios de células ATII, así como recién secretadas por los mismos, en forma de LBPs (Lamellar Body-like Particles), en comparación con el surfactante nativo (SN) purificado a partir de lavados broncoalveolares de animales, un material de referencia en estudios estructurales y funcionales. Los resultados de esta tesis han revelado que las membranas de SP, tanto en forma de LBs como de LBPs, presentan propiedades estructurales y funcionales muy diferentes a las del SN. En particular, los LBs muestran un alto grado de empaquetamiento y deshidratación, que se mantiene cuando son secretados al medio extracelular en forma de LBPs, incluso a temperaturas suprafisiológicas. Asimismo, los resultados apuntan a la posible existencia en los LBPs de organizaciones distintas a las típicas de fases lamelares. Desde un punto de vista funcional, los LBPs recién secretados demuestran una superior eficiencia en términos de adsorción, así como una significativa resistencia a agentes inhibitorios, incluso a altas concentraciones de éstos, en comparación con los complejos de SN. En vista de estos resultados, se concluye que la particular complejidad interna que adoptan los lípidos y proteínas dentro de los LBPs podría conferirles propiedades críticas para una eficacia máxima en la formación de películas interfaciales y por tanto para la función surfactante. Un detallado análisis del SN ha corroborado la naturaleza heterogénea de las preparaciones purificadas a partir de lavado broncoalveolar, conteniendo no sólo estructuras activas sino también material menos eficiente y con una reducida actividad biofísica, correlacionada con una diferente ultraestructura y composición bioquímica. El material menos activo es posible que corresponda a surfactante ya ¿gastado¿ o ¿desactivado¿ o con funciones alternativas más allá de la reducción de la tensión superficial. Sin embargo, a pesar de la utilidad y fiabilidad demostradas por los cultivos primarios de células ATII, éstas tienen la desventaja de perder su fenotipo diferenciado en cultivo y son incapaces de sintetizar surfactante de novo una vez son extraídas del pulmón, lo cual impide llevar a cabo estudios sobre la biogénesis del SP. En vista de la necesidad de un modelo bien establecido de célula ATII, en esta Tesis se ha desarrollado y caracterizado un nuevo modelo celular basado en la diferenciación pulmonar de células madre humanas mesenquimales derivadas de la decidua placentaria, hasta dar lugar a unas células que hemos denominado ATII-LCs (Alveolar Type II-Like Cells). Estas células diferenciadas son capaces de expresar marcadores alveolares a nivel génico y proteico, así como sintetizar y almacenar fosfolípidos característicos del SP en orgánulos similares a LBs. Igualmente, tras estimulación fisiológica, las ATII-LCs secretan al medio extracelular complejos surfactantes con una rápida capacidad de adsorción y resistencia a inactivación. Asimismo, el modelo de ATII-LCs es sensible a la citotoxicidad de compuestos nanoestructurados de interés biofarmacéutico, constituyendo una potencial herramienta de cribado para detectar potenciales riesgos de nanofármacos en sus primeras etapas de desarrollo.